La combinación de dos cepas de sexado genético permite clasificar especies no

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 646 (2023) Citar este artículo

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El control químico de los mosquitos vectores de enfermedades Aedes albopictus y Aedes aegypti es costoso, insostenible y cada vez más ineficaz debido a la propagación de la resistencia a los insecticidas. La técnica del insecto estéril es una alternativa valiosa, pero está limitada por métodos de separación por sexos lentos, propensos a errores y derrochadores. Aquí presentamos cuatro cepas de sexado genético (dos para cada especie de Aedes) basadas en marcadores de fluorescencia vinculados a los loci sexuales m y M, lo que permite el aislamiento de machos transgénicos. Además, demostramos cómo la combinación de estas cepas de sexado permite la producción de machos no transgénicos. En una instalación de cría masiva, se podrían clasificar 100.000 larvas masculinas de primer estadio en menos de 1,5 h con una contaminación femenina estimada del 0,01% al 0,1% en una sola máquina. Los análisis de rentabilidad revelaron que el uso de estas cepas podría generar ahorros importantes al instalar y operar una instalación de cría masiva. En conjunto, estas cepas de sexado genético deberían permitir una importante ampliación de los programas de control contra estos importantes vectores.

Aedes aegypti y Aedes albopictus son especies de mosquitos invasores responsables de la transmisión de muchos patógenos, incluidos los virus del dengue (DENV), chikungunya (CHIKV), Zika (ZIKV) y fiebre amarilla (YFV)1,2. Impulsados ​​por el cambio climático y el comercio mundial, ambos vectores se están propagando rápidamente y se prevé que el 49% de la población mundial estará en riesgo de contraer enfermedades transmitidas por Aedes en 2050 en ausencia de medidas de control efectivas3,4.

La supresión de las poblaciones de mosquitos mediante el control genético es una de las alternativas al uso de insecticidas más eficaces, sostenibles y respetuosas con el medio ambiente. Se basa en liberaciones masivas repetidas de mosquitos macho que no pican, ya sea estériles (la técnica de los insectos estériles, SIT5 y sus derivados, incluido pgSIT6), infectados con Wolbachia (la técnica de los insectos incompatibles, IIT7,8,9), ambos10,11, o portador de un transgén letal (Liberación de insectos portadores de un transgén letal, RIDL)12. Para todas estas intervenciones, se requiere un método eficaz de separación de sexos. Actualmente, los mosquitos Aedes se sexan basándose en el dimorfismo natural del tamaño de las pupas utilizando un clasificador de Hoch, que puede ser totalmente manual13,14 o parcialmente automatizado11. Este método, que requiere un tamaño de pupa homogéneo y, por lo tanto, condiciones de cría de larvas con densidad optimizada, sufre tasas de contaminación femenina de entre 0,8 y 1% y una alta variabilidad diaria y de usuario a usuario15. En particular, recientemente se describió un clasificador de pupas y adultos de varios pasos que permitió una contaminación femenina de 1,13 × 10-7%9. Sin embargo, este sistema, como todos los demás métodos existentes, comparte el inconveniente de clasificar en una etapa tardía y recuperar menos de la mitad de los machos criados14, lo que significa que >75% del total de pupas se crían y alimentan en vano.

En los mosquitos Anopheles, se han descrito cepas transgénicas de sexado genético (GSS) que permiten la separación sexual automática de larvas jóvenes16,17,18,19. Los marcadores fluorescentes muestran una expresión específica de los hombres, ya sea mediante el uso de secuencias reguladoras específicas de los hombres o uniendo marcadores al cromosoma Y. Una cepa de sexado de Anopheles coluzzii está ligada al cromosoma X20, lo que hace que las hembras sean más fluorescentes que los machos. La separación de sexos se logra utilizando un dispositivo clasificador y analizador paramétrico de objetos complejos (COPAS), que funciona como un citómetro de flujo y clasifica partículas grandes según su fluorescencia. Además, como alternativa a la liberación de machos transgénicos, se propuso un esquema de cruce que genera poblaciones exclusivamente de machos no transgénicos utilizando COPAS21. Este esquema requiere una cepa que lleve un marcador de fluorescencia en el cromosoma Y y otra que lleve un marcador de fluorescencia en el cromosoma X. El cruce de hembras no transgénicas (X-/X-) de la primera cepa con machos transgénicos (X+/Y-) de la segunda da como resultado una progenie compuesta por hembras transgénicas (X+/X-) y hembras no transgénicas (X-/Y-). −) machos.

En los mosquitos Aedes existen GSS que permiten la clasificación sexual de los machos transgénicos. Dos estudios han propuesto el uso de un fenotipo no volador reprimible específico de la mujer22,23. En este sistema, los machos y las hembras transgénicos se liberan juntos, pero las hembras adultas no sobreviven mucho tiempo porque no pueden volar. Se ha desarrollado y adaptado a Ae. aegypti para SIT6,24. Sin embargo, este sistema requiere una perfecta clasificación sexual de las cepas parentales que se van a cruzar; de lo contrario, se podrían liberar mosquitos transgénicos fértiles (algunos de ellos homocigotos para un transgén Cas9). En Ae. aegypti, también se ha desarrollado un GSS de ojos rojos que ha demostrado ser eficaz para la clasificación en la etapa de pupa, pero requiere automatización25. Recientemente, desarrollamos un GSS para Ae. albopictus que lleva un marcador de fluorescencia dentro de un casete transgénico masculinizante, lo que permite la separación automatizada de machos transgénicos de hembras no transgénicas26.

Aquí, examinamos si se podría diseñar un esquema de cruce similar al de Anopheles en mosquitos Aedes a pesar de la ausencia de cromosomas sexuales heteromórficos. En Aedes, el sexo está codificado por loci sexuales no homólogos ubicados en el primer par de autosomas. El locus masculino se denomina “M”, mientras que el locus común se denomina “m”; por tanto, las hembras son m/m y los machos son m/M. Estos loci sexuales tienen aproximadamente 1,18 Mbp de longitud en Ae. aegypti27, y están delimitados por factores antagónicos que los protegen de la recombinación28,29. Están incrustados dentro de una región de 63 Mbp con una fuerte diferenciación genética macho-hembra, en la que la recombinación permanece suprimida30. En consecuencia, vincular un transgén marcador de fluorescencia a los loci sexuales de Aedes o a la región no recombinante circundante podría permitir la clasificación automatizada de machos transgénicos directamente de una cepa ligada a M, o de machos no transgénicos después de cruzar machos transgénicos m hemicigotos con hembras de tipo salvaje. En este trabajo, desarrollamos dos GSS para ambas especies de vectores de Aedes, uno vinculado al locus M y otro al locus m, mediante edición genómica y transgénesis. Mostramos que estos GSS pueden usarse por separado para liberar mosquitos transgénicos o combinarse para purificar grandes poblaciones de machos de tipo salvaje. Discutimos la idoneidad del método para la cría masiva y las liberaciones inundativas.

En Ae. aegypti, la vinculación de un transgén marcador eGFP a los loci m y M se logró mediante la activación CRISPR-Cas9 dirigida a un gen de mucina-3A, AAEL019619, que se predijo que sería central para la región no recombinante que abarca los loci sexuales por Fontaine y colegas30 (Fig. 1a, b, consulte Métodos para obtener más detalles). Aislamos un Ae. aegypti ligada a M que denominamos Aaeg-M, y una cepa de Ae. aegypti cepa ligada a m que denominamos Aaeg-m. La fluorescencia de GFP expresada a partir de un promotor ubicuo permite la separación de sexos en la primera etapa larvaria: en Aaeg-M, los machos expresan GFP mientras que las hembras no son transgénicas (Fig. 1a) y en Aaeg-m, los machos expresan una copia del transgén GFP. mientras que las hembras expresan dos copias, lo que da como resultado una fluorescencia más brillante (Fig. 1b). Ambas líneas fueron retrocruzadas 7 veces con un antecedente genético brasileño (Bra). En Ae. albopictus, el enlace M de los marcadores de fluorescencia se logró mediante inserciones preferenciales de piggyBac cerca del gen de masculinización, Nix, estimuladas por la inclusión de secuencias derivadas de Nix en el plásmido de transgénesis piggyBac (Fig. 1c, ver Métodos). Un fenómeno similar, denominado localización de transposones, se ha observado previamente para los elementos P en Drosophila31. Este enfoque produjo al menos ocho líneas con un enlace M estrecho de aproximadamente 60 inserciones de piggyBac seleccionadas (sorprendentemente, se obtuvo un enlace M débil o nulo con estas construcciones de piggyBac desprovistas de la secuencia de Nix). Entre los Ae. estrechamente ligados a M. albopictus, seleccionamos una que expresaba YFP, a la que denominamos Aal-M. La secuenciación (ver “Método de secuenciación dirigida” en la sección Métodos) reveló que el transposón había aterrizado en una secuencia no codificante en el andamio 16, ubicado en 1q12 según el último ensamblaje del genoma32. Obtener una segunda cepa de sexado con enlace m en ausencia de conocimiento de la cepa de Ae. Albopictus m secuencia del locus, seleccionamos> 120 inserciones aleatorias de piggyBac (Fig. 1d). La mejor línea de inserción ligada a m que obtuvimos mostró una frecuencia de recombinación del 0,1%. Su casete transgénico albergaba un transgén Cas9 asociado con un marcador de fluorescencia DsRed y estaba flanqueado por sitios lox. Como un transgén Cas9 no era deseable en una cepa de sexado, lo extirpamos utilizando la recombinasa CRE y lo reemplazamos con un transgén eGFP. Este Ae. albopictus ligada a m se denominó Aal-m. La secuenciación de la secuencia genómica flanqueante del transposón indicó que había aterrizado en una región muy repetida; por lo tanto, no se pudo identificar su ubicación genómica exacta, pero coincidió con varios loci en 1q31 (ver Métodos y datos complementarios 1). Ambos Ae. Las líneas transgénicas de albopictus muestran un patrón claro de separación de sexos en los análisis COPAS (Fig. 1c, d). Las cuatro líneas se clasificaron mediante fluorescencia y se examinaron en cada generación. En la línea Aaeg-M, se registró visualmente un único evento de recombinación después de 15 generaciones (>10.000 individuos examinados en total). En consecuencia, estimamos que las líneas Aaeg-M y Aaeg-m se recombinan aproximadamente en un 0,01%. En Aal-M, se observaron cuatro individuos recombinantes en la décima generación después de examinar sucesivamente un total de >50.000 individuos. Es probable que estas recombinaciones hayan surgido de un solo evento, lo que sugiere que la recombinación también es extremadamente rara en la cepa Aal-M.

En Ae. aegypti, se utilizó un único objetivo CRISPR-Cas9 para obtener una cepa ligada a M (a) y una cepa ligada a m (b) en 2 a 4 generaciones. Ambas líneas permiten la separación de sexos utilizando un citómetro de flujo COPAS, como se muestra en los gráficos generados a partir de datos de clasificación representativos para estas líneas (unidades de fluorescencia arbitrarias). En Ae. albopictus, el enlace M se obtuvo mediante integración preferencial de piggyBac cerca del locus M estimulado por la presencia de secuencias de Nix, lo que requirió detección y pruebas durante 4 generaciones (c). “pB Trp” = plásmido auxiliar que expresa la transposasa piggyBac. En Ae. albopictus, el enlace m se obtuvo mediante integración aleatoria piggyBac mediante un cribado intensivo durante 6 generaciones (d). Luego, la línea ligada a m seleccionada se modificó para eliminar transgenes indeseables usando CRE-recombinasa (“CRE”), una integrasa (“INT”) y un plásmido que expresa GFP que se acopla al sitio attP que quedó después de la escisión del casete lox. Tanto Aal-M como Aal-m permiten la separación de sexos utilizando un citómetro de flujo COPAS (clasificación representativa de los datos reales mostrados, en unidades de fluorescencia arbitrarias COPAS). Figura diseñada en BioRender.com.

Se realizó un experimento piloto para obtener machos no transgénicos utilizando dos GSS tanto en Ae. aegypti y Ae. albopictus. En Ae. aegypti, 1000 hembras negativas de Aaeg-M se clasificaron mediante COPAS (Fig. 2a) y se cruzaron con 300 machos hemicigotos clasificados con COPAS de Aaeg-m (Fig. 2b). Su progenie (Aaeg-CS, 'CS' que significa 'Esquema de cruce') estaba compuesta por 65.839 larvas, de las cuales 32.960 eran negativas y supuestamente machos (Fig. 2c). Extrajimos 2000 de ellos mediante COPAS, y todos surgieron como machos no transgénicos. En Ae. albopictus, aplicamos el mismo esquema de cruce utilizando 850 hembras negativas de la cepa Aal-M cruzadas con 250 machos hemicigotos de la cepa Aal-m (Fig. 2d-e). En su progenie, obtuvimos 24,239 larvas de Aal-CS, de las cuales 12,173 fueron negativas y presumiblemente machos (Fig. 2f). De las 2000 larvas extraídas con COPAS negativas, se recuperaron y verificaron visualmente 1468 pupas, lo que revela la presencia de una hembra contaminante no transgénica, lo que es consistente con la tasa de recombinación estimada del 0,1% de la cepa Aal-m.

Los paneles muestran los gráficos de fluorescencia log(Verde) = f(log(Rojo)) mostrados por el software COPAS. El software no muestra escalas ya que utiliza unidades de fluorescencia arbitrarias. Se definieron regiones cerradas para clasificar las poblaciones de interés. Es de destacar que tanto los fluorocromos GFP como YFP se pueden leer en modo GFP. a Selección de hembras no transgénicas de la cepa Aaeg-M. Total de larvas = 6079. b Clasificación de machos transgénicos hemicigotos de la cepa Aaeg-m. Total de larvas = 711. c Clasificación de machos no transgénicos en la progenie de 1000 hembras no transgénicas de la cepa Aaeg-M cruzadas con 300 machos transgénicos hemicigotos de la cepa Aaeg-m. Larvas totales = 65.839. d Clasificación de hembras no transgénicas de la cepa Aal-M. Total de larvas = 6797. e Clasificación de machos transgénicos hemicigotos de la cepa Aal-m. Total de larvas = 1960. f Clasificación de machos no transgénicos en la progenie de 850 hembras no transgénicas de la cepa Aal-M cruzadas con 250 machos transgénicos hemicigotos de la cepa Aal-m. Larvas totales = 24.239. Se observó que las larvas de fluorescencia intermedia eran larvas fluorescentes muertas o larvas con menor expresión de GFP en el momento de la clasificación. Se confirmó que todos los individuos que alcanzaron la etapa de pupa eran machos. Figura diseñada en BioRender.com.

La aptitud de las líneas M y ligadas a m seleccionadas, así como de la colonia intermediaria del esquema de sexado (hembras no transgénicas de la línea ligada a M cruzadas con machos transgénicos hemicigotos de la línea ligada a m), se analizó mediante examinando los siguientes parámetros: proporción de sexos, fecundidad (número de huevos por hembra), tasa de eclosión de huevos y supervivencia desde la larva hasta la edad adulta. En Ae. aegypti, las líneas Aaeg-M, Aaeg-m y la colonia intermediaria del esquema de cruce (Aaeg-CS) mostraron proporciones de sexos similares a las de la línea Bra WT (Fig. 3a, Tabla complementaria 1 y Datos 2). La fecundidad de Aaeg-M y Aaeg-m no fue diferente de la de Bra (WT), mientras que Aaeg-CS tuvo una mayor fecundidad (Fig. 3b). Los huevos de Aaeg-M eclosionaron de manera similar a los huevos de Bra, mientras que los huevos de Aaeg-m y los huevos de Aaeg-CS eclosionaron significativamente mejor (Fig. 3c). La supervivencia desde la larva del primer estadio hasta la etapa adulta no fue significativamente diferente en Aaeg-M, Aaeg-m y Aaeg-CS en comparación con Bra (Fig. 3d). En Ae. albopictus, las proporciones de sexos de las líneas Aal-M, Aal-m y Aal-CS no fueron significativamente diferentes de las de la línea natural BiA (Fig. 3e). Aal-M tuvo una fecundidad significativamente mayor que BiA (WT), mientras que Aal-m y Aal-CS tuvieron fecundidades similares a WT (Fig. 3f). Los huevos de las líneas Aal-M y Aal-CS tuvieron una tasa de eclosión ligeramente mayor que los huevos de BiA (WT), mientras que los huevos de Aal-m eclosionaron de manera similar (Fig. 3g). La supervivencia desde larvas L1 hasta adultos aumentó marginalmente en Aal-M y Aal-m en comparación con BiA (WT), mientras que no fue significativamente diferente en la progenie del esquema de cruce (Aal-CS, Fig. 3h).

En todos los paneles, los puntos negros con barras verticales representan el valor medio y el IC del 95% en el Ae. aegypti y Ae. ensayos de albopictus, respectivamente. Los grandes puntos de colores alrededor de las estimaciones representan los valores medios de cada réplica (N). Las diferencias significativas entre las líneas se especifican en la figura (ns: sin diferencia significativa. *valor de p < 0,1, **valor de p < 0,01, ***valor de p < 0,001). Los porcentajes de machos se compararon mediante un modelo lineal generalizado con distribución binomial en el Ae. aegypti (a) y Ae. líneas albopictus (e). Las comparaciones del número medio de huevos puestos por una hembra individual se analizaron utilizando un modelo de obstáculos con una distribución binomial negativa en Ae. aegypti (b) y Ae. líneas albopictus (f). La importancia del modelo de obstáculos se muestra en dos partes: probabilidad de valores distintos de cero y probabilidad de alcanzar el valor 0 (entre paréntesis). Las comparaciones del porcentaje de eclosión de huevos se analizaron mediante un modelo lineal generalizado con distribución binomial en Ae. aegypti (c) y Ae. líneas albopictus (g). La comparación de la supervivencia desde el primer estadio larvario hasta el estadio adulto se analizó utilizando un modelo lineal con el supuesto de normalidad residual en Ae. aegypti (d) y Ae. líneas albopictus (h). Figura diseñada en BioRender.com.

En un enfoque operativo SIT, se producirían machos transgénicos de las líneas ligadas a M o machos no transgénicos del esquema de cruce para su liberación. Con este objetivo, evaluamos su aptitud mediante ensayos de competitividad, pruebas de vuelo y pruebas de supervivencia de dos semanas en condiciones de laboratorio. Probamos la competitividad de los machos transgénicos colocando 30 machos transgénicos y 30 machos WT en una jaula con 30 hembras vírgenes WT y midiendo el porcentaje de progenie transgénica en su descendencia. En el ensayo de competitividad entre machos transgénicos y no transgénicos en Ae. aegypti, Aaeg-M se desempeñó de manera igual a Bra (WT) y Aaeg-CS (Fig. 4a, Tabla complementaria 1). En Ae. albopictus, dada la mayor tasa de eclosión y fecundidad de Aal-M en comparación con BiA (WT) y Aal-CS, una competitividad igual daría como resultado porcentajes de larvas de Aal-M más altos de lo esperado en ambos ensayos de competitividad. Aal-M mostró una competitividad de 0,59 en comparación con BiA (WT) y una competitividad similar en comparación con Aal-CS (Fig. 4b), lo que significa que tanto Aal-M como Aal-CS tuvieron una competitividad reducida en comparación con WT. La capacidad de vuelo de los machos se evaluó mediante una prueba estandarizada que consistió en colocar 100 machos en una pequeña taza en el fondo de tubos verticales coronados por un ventilador y contar cuántos machos logran escapar a través de los tubos33. En las pruebas de vuelo, Ae. aegypti los machos transgénicos y los machos no transgénicos del esquema de cruce se desempeñaron tan bien como los machos de control, mientras que en Ae. albopictus, las tasas de escape de los machos Aal-M fueron marginalmente más bajas y las de los machos Aal-CS ligeramente más altas que las de WT, sin diferencias significativas (Fig. 4c, d). La supervivencia de los adultos se controló durante dos semanas y no se observaron diferencias significativas entre los machos transgénicos, los machos no transgénicos del esquema de cruce y los machos de sus respectivas líneas WT (Fig. 4e-f).

Los puntos negros con barras verticales representan el valor medio y el IC del 95% en los ensayos de competitividad y capacidad de vuelo de los machos. Los puntos finos de colores en los cuadrados encima y debajo de las estimaciones representan puntos de datos individuales (n), mientras que los puntos de colores grandes alrededor de las estimaciones representan los valores medios de cada réplica (N). Las diferencias significativas entre las líneas se indican en la figura (ns: sin diferencia significativa. *valor de p < 0,1, **valor de p < 0,01, ***valor de p < 0,001). La competitividad de los machos de la línea Aaeg-M en relación con Bra (WT) o Aaeg-CS en Ae. aegypti (a) y la competitividad de los machos de la línea Aal-M en relación con BiA (WT) y Aal-CS en Ae. albopictus (b) se compararon midiendo el número de larvas L1 transgénicas y no transgénicas en la progenie de cada una de las N = 5 réplicas. Los resultados se compararon con el porcentaje esperado si los machos transgénicos fueran tan competitivos como los machos no transgénicos (línea discontinua) y se analizaron utilizando un modelo generalizado de efectos mixtos con una distribución binomial y réplicas como un efecto aleatorio. La capacidad de vuelo de los machos transgénicos y no transgénicos en comparación con el tipo salvaje en Ae. aegypti (c), y Ae. albopictus (d) se probó mediante N = 3 réplicas en un dispositivo de prueba de vuelo de referencia (“FTD”). Los resultados se analizaron mediante un modelo generalizado de efectos mixtos con distribución binomial y réplicas como efecto aleatorio. Se monitoreó la supervivencia de machos adultos 14 días después de la emergencia en Ae. aegypti (e) y Ae. líneas albopictus (f). Se realizaron N = 4 réplicas para cada línea. Todos los valores están por encima del 90%, el eje y es discontinuo entre 0 y 90% para una mejor visualización. La supervivencia de los machos a los 7 y 14 días se comparó mediante la prueba de rangos logarítmicos y ninguna comparación fue significativamente diferente. Figura diseñada en BioRender.com.

Para evaluar la confiabilidad de la clasificación COPAS para la producción masiva de machos de alto rendimiento en una instalación de producción de mosquitos, evaluamos la tasa de contaminación en función de la velocidad de clasificación. Un grupo de 10,000 larvas de primer estadio de Aaeg-CS (hembras fluorescentes + machos no fluorescentes) se clasificaron repetidamente mediante COPAS y medimos la tasa de recuperación de los machos y la tasa de contaminación de las hembras a diferentes velocidades de clasificación. La clasificación a una velocidad determinada se repitió N = 3 veces. Observamos que el porcentaje de recuperación disminuyó de 91,5 ± 1,4% a 26,9 ± 1,9% al aumentar la velocidad de clasificación de 6 a 300 larvas/seg, siguiendo un modelo de regresión polinómica de grado dos (R2 = 0,983), mientras que la contaminación permaneció ausente por debajo. 300 larvas/seg (Fig. 5a). Proponemos que una velocidad operativa para la clasificación por sexo sería de alrededor de 60 larvas/seg (lo que corresponde a 200 larvas/ml en el agua del depósito con la configuración de nuestros instrumentos) con una tasa de recuperación media de 69,6 ± 1,1 % y no se detectó contaminación femenina entre más de 6500 machos clasificados. A esta velocidad, un pequeño depósito de COPAS (250 ml) contiene 50.000 larvas que se clasifican en <14 min, lo que produce aproximadamente 17.400 ± 270 machos (considerando una proporción de sexos de 50:50). En consecuencia, se podrían clasificar 100.000 machos en menos de 1,5 horas. La misma prueba se repitió con Ae. albopictus larvas y dieron resultados comparables (Fig. 5a).

a Evolución de las tasas de recuperación de machos y contaminación de hembras en función de la velocidad de clasificación de COPAS. 10.000 Ae. aegypti L1 del esquema de cruce se clasificaron mediante COPAS en diferentes concentraciones, lo que resultó en diferentes velocidades de clasificación. Se midieron el porcentaje de recuperación (puntos negros) y el porcentaje de contaminación (puntos rojos) en tres réplicas para cada velocidad de clasificación. Los valores de recuperación se ajustaron mediante una regresión polinómica de grado dos (R2 = 0,983) y los valores de contaminación se ajustaron mediante una regresión lineal (R2 = 0,556). Las predicciones del modelo se trazaron mediante líneas negras y rojas, respectivamente, con cintas de intervalos de confianza del 95%. Se repitió el mismo experimento con 4000 Ae. albopictus L1 del esquema de cruce y se muestra en el mismo gráfico. En esta especie, el porcentaje de recuperación (triángulos negros) y el porcentaje de contaminación (triángulos rojos) se midieron en una única réplica para cada velocidad de clasificación. b–g Estimación de la rentabilidad de las cepas de sexado genético de Aedes SIT mediante la simulación de la construcción de una instalación de cría masiva y una instalación de liberación con diferentes sistemas de sexado. Los sistemas de sexado incluidos fueron la clasificación manual de pupas utilizando placas de vidrio, “Tamaño manual” (líneas discontinuas negras), la clasificación automatizada de pupas con placas de vidrio robóticas, “Tamaño automático” (líneas discontinuas grises), la clasificación automatizada de larvas L1 de un GSS que utiliza COPAS, “GSS” (líneas de color verde claro) y la combinación de dos GSS para la clasificación automatizada de larvas L1 no transgénicas, “GSS-CS” (líneas de color verde oscuro). Se plantearon diferentes objetivos de producción: liberación de 5, 10, 20, 50 y 100 millones de machos por semana durante 52 semanas al año. b Comparación del número de larvas presentes en cualquier momento en las instalaciones de cría. c Comparación del costo de construcción en dólares estadounidenses tanto para las instalaciones de cría masiva como para las de liberación. d Comparación del costo del equipo en dólares estadounidenses para las instalaciones de cría masiva y de liberación (costo anual estimado dividiendo el costo de cada equipo por su vida útil). e Comparación del costo de la dieta y los consumibles por año en dólares estadounidenses tanto para las instalaciones de cría masiva como para las de liberación. f Suma de los costos anuales de construcción (vida útil estimada = 20 años), equipo, dieta y consumibles en dólares estadounidenses. g Comparación del número de personal (obreros, gerentes, etc.) necesario tanto para las instalaciones de cría masiva como para las de liberación. h Inversión cromosómica propuesta que podría evitar la recombinación entre el marcador de fluorescencia y el locus sexual. Figura diseñada en BioRender.com.

Al permitir la separación de machos y hembras en el primer estadio larvario (L1), se reduce considerablemente el número de estadios larvarios y pupas posteriores que se criarán en una instalación de cría masiva. Sin embargo, dadas las tasas de recombinación de nuestras líneas transgénicas, se requieren colonias adicionales en las instalaciones de cría masiva que se verificarían dos veces para eliminar todos los contaminantes (denominadas "colonias filtrantes"). Además, es necesario adquirir costosos dispositivos de clasificación de fluorescencia, como COPAS. Adaptando la 'HOJA DE CÁLCULO INTERACTIVA DE LA FAO/OIEA PARA EL DISEÑO DE INSTALACIONES DE CRIADURA EN MASA Y MANEJO DE MACHOS'34 (ver Métodos y datos complementarios 3), estimamos el número de insectos a criar, el tamaño de las instalaciones, la mano de obra, la construcción, el equipo y costos de consumibles, etc. Estas estimaciones se compararon entre los procedimientos estándar de cría y clasificación (en lo sucesivo denominados 'Tamaño manual' para la clasificación manual de pupas en función de su dimorfismo de tamaño13, y 'Tamaño automático' para la clasificación automatizada de pupas desarrollado para el IIT-SIT en Guangzhou, China11), así como el uso de un único GSS (clasificación de machos transgénicos, denominado 'GSS') y el uso de dos GSS combinados para la clasificación de machos no transgénicos (denominados 'GSS-CS', ' CS' significa 'Crossing Scheme'). Consideramos el caso de GSS-CS (para producir machos no transgénicos) por separado del de GSS ya que requiere dos colonias de cría (una para cada cepa a utilizar) y dos colonias de filtro en lugar de una (ver 'Procesos de cría masiva ' esquemas en Datos complementarios 3), que se traducen en más mosquitos para criar y que requieren espacio y equipo adicionales. Para todos los métodos, se probaron diferentes escalas de liberación (es decir, 5, 10, 20, 50 y 100 millones de machos liberados por semana) de acuerdo con lo que se está haciendo actualmente en los ensayos de campo de control genético contra Aedes (5 y 10 M/semana). y qué sería operativamente relevante para un control más amplio del Aedes35. Observamos que tanto GSS como GSS-CS permiten reducciones importantes en el número de insectos a criar en comparación con el estándar, sin importar la escala de liberación e incluyendo las colonias filtrantes (GSS vs. Tamaño manual = −65% larvas y −25 –30% adultos, GSS-CS vs. Manual de tamaño = −46% larvas y −8–17% adultos, ver Fig. 5b y Datos complementarios 3). Estas reducciones se traducen en reducciones en el tamaño de las instalaciones de cría masiva y, por lo tanto, en el costo de construcción: se estima que el tamaño de las instalaciones y el costo de construcción se reducirán entre un 22 % y un 43 % en GSS y entre un 12 % y un 28 % en GSS-CS en comparación con el tamaño manual ( Figura 5c). Dados los altos costos actuales de los dispositivos COPAS (según cotizaciones recientes, consideramos $40 mil por un dispositivo reacondicionado), los costos del equipo aumentan en GSS-CS en comparación con la clasificación manual de pupas (+9 a +18% anual, Fig. 5d ) mientras que se estima que GSS por sí solo tiene el costo de equipo más bajo de 10 millones de machos/semana (-5 a -16% anual en comparación con el manual de tamaño, Fig. 5d). Sin embargo, los costos de consumibles, incluidos los costos de la dieta de los insectos, también se reducen y permiten ahorros importantes a partir de 20 millones de machos/semana y más (GSS vs. Manual de talla = −54%, GSS-CS vs. Manual de talla = −37%, con ahorros >$50,000 con 20 millones de hombres/semana y más, Fig. 5e). En total, considerando los costos de construcción, equipo, dieta y consumibles, se predice que GSS será la opción más económica en todos los rendimientos probados, mientras que GSS-CS comienza a ser más económico en comparación con la clasificación manual de pupas de un rendimiento de 10 millones de machos/semana. (Figura 5f). Además, la carga de trabajo, cuyo costo sólo puede estimarse país por país, se reduce entre un 29% y un 38% con GSS y entre un 18% y un 27% con GSS-CS (Fig. 5g). En todas las comparaciones, incluido el coste del equipo, la opción más cara es la clasificación automática de pupas, ya que los dispositivos son caros (por ejemplo, 40.000 dólares para el clasificador automático de11, J. Bouyer) y el número de insectos a criar es elevado (Fig. .5b-g).

Aquí presentamos las primeras cepas de sexado genético (GSS) de Ae. aegypti y Ae. albopictus basado en marcadores fluorescentes transgénicos unidos a m/M. Demostramos que las cepas Aaeg-M y Aal-M ligadas a M se pueden usar solas para sexar larvas transgénicas de primer estadio y que las cepas ligadas a M y m de cada especie también se pueden combinar para producir una población masculina no transgénica. mediante dos rondas de selección por sexo (de las líneas parentales y de la descendencia del cruce). En Ae. aegypti, se encontró que los machos transgénicos de la cepa ligada a M y los machos no transgénicos del esquema de cruce eran al menos tan aptos y competitivos como los machos de tipo salvaje de la misma cepa de laboratorio. En Ae. albopictus, se observó una leve reducción de la competitividad en machos transgénicos Aal-M así como en machos no transgénicos Aal-CS. La razón de esto no está clara, especialmente porque los machos Aal-CS no son transgénicos. A una velocidad de 60 larvas/segundo usando un dispositivo COPAS, estimamos que se pueden obtener 100.000 machos en menos de 1,5 h con la configuración actual, recuperando el 70% de machos y con una contaminación de hembras del 0,01-0,1%.

Inesperadamente, observamos eventos raros de recombinación entre el transgén y el locus M en la línea Aaeg-M después de examinar decenas de miles de larvas. En esta línea, el transgén se encuentra aproximadamente a 9 Mbp de Nix, que permanece dentro de la supuesta región no recombinante30. En comparación con la probabilidad de recombinación entre dos marcadores separados por la misma distancia en loci ordinarios (3,4–4,7% según la información genómica más reciente27), estos resultados confirman que la recombinación está fuertemente reducida en esta región, pero no totalmente suprimida. Aunque aún no se ha observado, se espera que la línea Aaeg-m se recombine con la misma frecuencia que Aaeg-M, ya que ambos transgenes se insertan en el mismo gen diana a una distancia similar de sus respectivos loci sexuales. Desafortunadamente, los eventos de recombinación implican que estos GSS requerirán una purificación regular de las colonias parentales para evitar una acumulación gradual de individuos recombinantes. Es de destacar que estos eventos de recombinación son fáciles de detectar en lotes de pupas de un solo sexo debido al dimorfismo de tamaño y la protandria, lo que facilitará el control de calidad regular de cada cepa.

Aunque nuestros intentos iniciales de introducir un marcador de GFP en el intrón grande de Nix fracasaron, se pueden construir GSS mejorados apuntando a regiones más cercanas o dentro de los loci sexuales, especialmente en Ae. aegypti que se beneficia de un genoma completamente ensamblado. En Ae. albopictus, también se encontraron eventos de recombinación raros en Aal-M entre más de 10.000 individuos examinados durante 10 generaciones. Para una edición del genoma más precisa, sería necesario un mejor ensamblaje del primer cromosoma en esta especie. La posibilidad de inestabilidad genética en condiciones de cría masiva y la aparición de recombinantes sexuales aberrantes ya se ha informado en el desarrollo de GSS en otros organismos modelo de insectos36. Alternativamente, la creación de inversiones cromosómicas viables que abarquen el locus determinante del sexo y el transgén fluorescente, similar a un cromosoma equilibrador, podría ayudar a suprimir el entrecruzamiento (Fig. 5h) 37,38. Sin embargo, será necesario analizar cuidadosamente las inversiones para garantizar que no introduzcan costos de aptitud no deseados en la cepa de sexado que se han observado en otras especies39. Finalmente, recientemente hemos informado que el Ae. Los pseudomachos albopictus masculinizados por expresión ectópica de Nix se pueden utilizar como Aal-M GSS en el que el marcador fluorescente mostrará una vinculación absoluta con el sexo26. Este tipo de GSS es particularmente interesante para la producción de machos no transgénicos, ya que en este caso las hembras de tipo salvaje derivadas de la línea Aal-M y utilizadas en el esquema de cruce son no transgénicas y están desprovistas de cualquier contaminación recombinante.

Las tasas de contaminación femenina de nuestros GSS (0,01 a 0,1% dependiendo de los eventos de recombinación) son más altas que las del clasificador de varios pasos9 de Verily, pero mucho más bajas que las de los clasificadores de vidrio manuales13 o automatizados11. Es de destacar que en ensayos recientes de SIT-IIT se consideró aceptable hasta un 0,3 % de mujeres contaminantes11,40, mientras que para SIT solo se tolera hasta un 1 %5,35,41,42,43. Además, las mujeres contaminantes serían sometidas a la misma dosis de irradiación que los hombres, lo que se ha demostrado que causa un 100% de esterilidad en las mujeres44. Por lo tanto, la principal preocupación con respecto a estas tasas de contaminación es que las hembras contaminantes deben ser eliminadas de las colonias en las instalaciones de cría masiva para que no se acumulen. Esto se ha considerado en nuestras simulaciones al incluir colonias filtrantes que se clasificarían por sexo como larvas y se verificarían dos veces como pupas. En los casos en los que se requiere una contaminación cercana al 0% en los lotes de liberación, también se podría implementar un paso de control de calidad utilizando clasificadores de pupas automatizados antes de la aparición de los adultos.

En comparación con los métodos actuales de separación de sexos en los mosquitos Aedes9,11,13,45,46, estos GSS permiten una mayor recuperación de machos que cualquier método de clasificación basado en el tamaño de la pupa (alrededor del 70 % frente al 30 %). Nuestro sistema ofrece una velocidad de clasificación similar a la del clasificador de vidrio automatizado, que es mayor que la de los clasificadores de tamaño manuales y los clasificadores de varios pasos. En comparación con todos estos métodos disponibles actualmente, la principal ventaja de nuestros GSS es permitir la clasificación en la etapa más temprana de desarrollo, lo que resulta en ahorros significativos en espacio, tiempo y costos que de otro modo se gastarían en criar individuos innecesarios. Además, reducir el número de hembras que alcanzan la etapa de pupa en las instalaciones de cría masiva disminuye la molestia de las obreras por morder, un problema que se observa frecuentemente con los métodos de clasificación de pupas, debido a la aparición temprana de adultos.

Además, proponemos una estrategia de cruce que demostró ser efectiva en la obtención de machos no transgénicos. Esta estrategia podría ser particularmente útil en países donde los insectos genéticamente modificados no están estrictamente prohibidos pero donde la liberación de mosquitos transgénicos podría causar una gran preocupación pública. En comparación con la clasificación de pupas por tamaño utilizando placas de vidrio o tamices metálicos, tiene la ventaja de automatizar todos los pasos de clasificación y lograr tasas de contaminación femenina mucho más bajas. Aunque requiere la cría de dos cepas más la clasificación de los machos en las instalaciones de cría masiva, esto todavía representa una reducción de aproximadamente el 46% en el número de larvas de mosquito criadas para las clasificaciones manuales actuales basadas en el tamaño. A pesar del alto costo de los dispositivos de clasificación y del mayor número de insectos que con GSS, se prevé que este método sea más rentable que la clasificación automatizada de pupas en todos los rendimientos y que la clasificación manual de pupas cuando se excede un rendimiento de producción de 10 M machos/semana.

De hecho, la liberación de machos no transgénicos provenientes de programas de cruzamiento puede ser más apropiada que la liberación de machos transgénicos en muchos países, ya que las liberaciones de mosquitos transgénicos enfrentan más oposición pública y restricciones regulatorias47. Por lo tanto, se pueden reducir los costos relacionados con las campañas de información y consulta pública, la participación de las partes interesadas y el cumplimiento de los procesos regulatorios. Estos aspectos deben tenerse en cuenta, ya que en el pasado la falta de información y consulta ha provocado una oposición pública tan fuerte que algunos programas de liberación han tenido que cancelarse47. Es de destacar que la recombinación en nuestros GSS daría como resultado la contaminación de los machos liberados por hembras irradiadas no transgénicas a una tasa igual a la tasa de recombinación; sin embargo, esta liberación de hembras estériles aún sería mucho menor en comparación con los métodos actuales.

Los errores de clasificación COPAS durante la purificación de machos no transgénicos fueron extremadamente raros en nuestros experimentos piloto. Sin embargo, tales contaminaciones pueden ocurrir debido a problemas técnicos ocasionales y darían lugar a la liberación de un pequeño porcentaje de mosquitos transgénicos entre los no transgénicos. Esto debería evitarse por completo en entornos donde los OGM estén prohibidos. Se podría lograr un paso de control de calidad adicional para eliminar cualquier larva fluorescente GFP residual de las larvas clasificadas mediante una segunda ejecución de COPAS. También podría lograrse mediante la verificación visual de las larvas clasificadas colectivamente bajo un microscopio de fluorescencia, ya que los positivos de GFP son fáciles de detectar y eliminar, incluso entre muchas larvas de tipo salvaje. Es de destacar que los GSS con un marcador de fluorescencia ligado a m muestran una separación de sexos menos obvia que los GSS ligados a M. Sin embargo, la contaminación del cruce de sexado con hembras homocigotas para el transgén produce una progenie transgénica que posteriormente se elimina al clasificar los machos no transgénicos. Además, la irradiación de todos los mosquitos antes de su liberación evitará la filtración de los transgenes a la población objetivo.

Aunque este trabajo se ha centrado en la producción de machos de Aedes para SIT, los mismos procedimientos para la producción de machos transgénicos o no transgénicos podrían aplicarse directamente en otros enfoques de control de mosquitos como IIT, RIDL, pgSIT u otros métodos de control genético actualmente en uso. desarrollo.

En conclusión, los cuatro GSS desarrollados en este trabajo representan herramientas muy prometedoras para mejorar la rentabilidad de la cría masiva de Aedes en los programas de control genético. Según nuestras pruebas piloto de laboratorio, una instalación que albergara dos máquinas COPAS podría producir 1.000.000 de larvas macho por día en un régimen de 7,5 horas. Teniendo en cuenta que no se crían hembras, se aliviarían las limitaciones de espacio. Además, esta técnica también reduciría los costes de producción asociados a la necesidad de alcanzar una contaminación femenina baja o nula, facilitando el cumplimiento de la normativa local. Nuestros resultados sugieren que la clasificación COPAS de nuestros GSS permitiría una producción masiva rápida, rentable y segura de mosquitos macho para TIE y otros métodos de control genético, con posibilidades flexibles de ampliación de acuerdo con las necesidades, recursos y regulaciones locales.

La Ae. La colonia de tipo salvaje (llamada BiA) se estableció a partir de larvas recolectadas en Bischheim (Francia, 48,36°N 07,45°E) en 2018. Ae. aegypti del origen genético de Bangkok obtenido de MR4-BEI se utilizaron para clonación molecular e ingeniería genética. Ae. aegypti cepa BgR9, derivada de Bangkok, y que expresa Cas9 bajo el control del promotor Exuperentia y un gen indicador DsRed bajo el promotor AePUb se utilizó para experimentos de activación CRISPR/Cas9 (secuencia del plásmido proporcionada en los Datos complementarios 4). El sujetador Ae. aegypti se originó en Juazeiro, Brasil, y fue proporcionada al IPCL en 2012 por Biofabrica Moscamed, un centro colaborador del OIEA en el desarrollo de la TIE contra mosquitos. Se utilizó para retrocruzar los transgenes de sexado.

Los mosquitos se mantuvieron en condiciones insectarias estándar (25–28 °C, 75–80% de humedad relativa, ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h). Las larvas se criaron en recipientes cuadrados de 35 cm en 1 litro de agua destilada y se alimentaron diariamente con alimento para peces molido TetraMin. Los mosquitos adultos se mantuvieron en jaulas de 16 × 16 × 16 cm y se les proporcionó una solución de azúcar al 10%. Las hembras fueron alimentadas con sangre de ratones anestesiados. Los huevos se pusieron sobre papel kraft húmedo y eclosionaron o se secaron después de 3 días.

La construcción de plásmidos empleó procedimientos estándar de biología molecular que incluyen la amplificación por PCR del ADN genómico utilizando la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (F530, Thermo Scientific, Francia), la clonación con NEBuilder® HiFi DNA Assembly (New England Biolabs, Francia), la clonación GoldenGate en las redes troncales de destino. utilizando la enzima de restricción Anza 36 Eco31I (Thermo Fisher Scientific, Francia), transformación en bacterias Escherichia coli competentes y purificaciones de plásmidos Miniprep o Endo-Free Midiprep (Macherey Nagel, Francia). Para CRISPR/Cas9 knock-in en el Ae. aegypti M y m loci, utilizamos los plásmidos pX4 y pX3 como donantes de reparación, respectivamente (Datos complementarios 4, Addgene #183903 y #183904). Para la integración de piggyBac cerca del Ae. albopictus M que produce la cepa Aal-M, utilizamos el plásmido ppBAalbNixE1E3E4 PUb-YFP (Addgene #173666 descrito en 26). Para la inserción aleatoria de piggyBac cerca del locus m, utilizamos el plásmido ppBExu-Cas9-sv40, cuyo casete lox (que abarca Cas9 y PUb-DsRed) se escindió posteriormente del genoma mediante inyección de un plásmido que expresa la recombinasa Cre bajo el control del promotor PUb, y se reemplazó insertando el plásmido pENTR-attB-PUb-GFP (Addgene #183911) en el sitio attP coinyectándolo con un plásmido que expresa integrasa del fago PhiC31 (Addgene #183966).

Las mezclas de inyección estaban compuestas por 400 ng/μl de ADN en 0,5x PBS. Las mezclas para inyección de piggyBac se prepararon como se describe en 20. Para los knock-ins CRISPR-Cas, la mezcla inicial se inyectó en el BgR9 Ae. aegypti La línea que expresa Cas9 comprendía gRNA de 84 µM, plásmido de reparación de 100 ng/µL y Scr7 de 2 µM. Dado el muy bajo número de transgénicos obtenidos (1 individuo de >20,000 larvas seleccionadas), posteriormente inyectamos el plásmido donante de reparación (190 ng/μL) con Scr7 5 μM y tres plásmidos que expresan diferentes gRNA bajo el control de diferentes promotores AeU6 ( 70 ng/μL cada plásmido). Este método proporcionó tasas de activación significativamente más altas (25 larvas positivas para GFP de aproximadamente 4000 analizadas).

La microinyección de embriones se realizó esencialmente como se publicó utilizando un microscopio invertido Nikon Eclipse TE2000-S, un inyector Eppendorf Femtojet y un micromanipulador TransferMan NK218 con las siguientes modificaciones: los huevos eclosionaron entre 3 y 8 días después de la inyección y las larvas del primer estadio se examinaron con un microscopio Nikon. Microscopio de fluorescencia SMZ18, solo las larvas G0 que mostraban expresión transitoria del gen indicador se retuvieron para el posterior cruzamiento.

Para apuntar a los loci sexuales, aprovechamos el trabajo de Fontaine et al. que muestra un grupo de marcadores dentro de una región no recombinante de 63 Mbp que abarca los loci sexuales con alta diferenciación genética macho-hembra y heterocigosidad masculina consistente con alelos nulos similares al cromosoma Y30 (Tabla complementaria 2). Las secuencias de ADN de estos marcadores con supuestos alelos nulos ligados a Y se bombardearon en el genoma AegL5 ensamblado para identificar una región de 4,9 Mb que se extiende desde 160.092.339 pb a 165.014.624 pb en el cromosoma 1 en el ensamblaje AegL5. Dentro de esta región no recombinante, seleccionamos el gen AAEL019619, ubicado a ~9 Mbp de distancia de Nix. Usamos el sistema CRISPR/Cas9 para activar un casete de marcador de fluorescencia de 2,3 kb (marcador eGFP bajo el promotor de poliubiquitina de Ae. aegypti - PUb) flanqueado por brazos de homología de 850-960 pb dentro del quinto intrón de 9 kb de este gen (construcción pX3), o para crear un intrón sintético dentro del exón 5 (construcción pX4). Obtuvimos una primera cepa ligada a M para Ae. aegypti tras la inyección de 200 óvulos de la cepa BgR9, que expresa Cas9 bajo el control del promotor Exuperentia, con el plásmido reparador pX4 y dos ARNg sintéticos (GATGAATCATGGGGCGCCT[GGG] y GATTCATCAATCAACGGAG[CGG], los paréntesis indican el motivo adyacente al protoespaciador, PAM ). Aproximadamente 30 larvas G0 que mostraban expresión transitoria de GFP se cruzaron en masa con un exceso de mosquitos de tipo salvaje. De más de 20.000 larvas G1 analizadas, se encontró una única larva masculina transgénica, criada hasta la edad adulta y cruzada con hembras WT. Su progenie estaba compuesta por 100% de hijos positivos para eGFP y 100% de hijas negativas para eGFP, lo que indica enlace M. A esto lo denominamos Ae. aegypti Cepa ligada a M Aaeg-M. Tras la inyección de 600 óvulos BgR9 con el plásmido reparador pX3 y una mezcla de tres plásmidos que expresan gRNA (GTGGCATAGCGCCGTGTGGA[GGG], GTCTTAAATGAAAGAGGCG[AGG], GTATCATGCGTATTGCGAG[AGG], los corchetes indican el PAM) bajo el control de tres promotores U6 diferentes (gRNA vectores de clonación: Datos complementarios 4), se recuperaron 43 larvas con expresión transitoria de eGFP en G0. Como resultado, 20 machos y 20 hembras fueron cruzados en masa con adultos del sexo opuesto. Se obtuvieron 25 larvas G1 transgénicas, de las cuales 10 eran machos que portaban una inserción ligada a M, 4 eran machos que portaban una inserción ligada a m y 11 eran hembras que portaban una inserción ligada a m. El sitio de inserción adecuado en AAEL019619 se confirmó mediante PCR en todos los individuos analizados, lo que reveló que en algunos de estos mosquitos se había integrado todo el plásmido de reparación. De un solo macho desprovisto de la columna vertebral del plásmido, se desarrolló un Ae. aegypti ligada a m denominada Aaeg-m se estableció y caracterizó aún más. Ambas líneas, Aaeg-M y Aaeg-m, se retrocruzaron con un fondo genético brasileño (Bra) durante 7 generaciones.

Tras varios intentos fallidos de colocar un marcador de fluorescencia cerca del Ae. albopictus gen Nix utilizando el sistema CRISPR/Cas9, aprovechamos la frecuente inserción espontánea cerca del locus M de construcciones de transposones piggyBac que transportan secuencias de ADN de Nix que informamos anteriormente26. En el curso de varios experimentos de transgénesis, utilizando construcciones piggyBac que portaban secuencias de Nix, obtuvimos 12 inserciones transgénicas independientes con un enlace M obvio del indicador de transgénesis (machos 100% fluorescentes), además de varias líneas femeninas masculinizadas que expresan Nix y líneas femeninas no Inserciones ligadas a M, no masculinizantes. A partir de la tercera generación, estas líneas se amplificaron para confirmar su vínculo M y estimar su tasa de recombinación. Seis líneas no mostraron recombinación de> 700 individuos seleccionados en cada línea hasta la sexta generación (Tabla complementaria 3). La mayoría de las otras líneas ligadas a M también mostraron machos 100% fluorescentes, pero contenían inserciones múltiples adicionales no ligadas a M y fueron descartadas. Con base en la aptitud de la línea y los perfiles COPAS, seleccionamos una línea YFP denominada Aal-M para seguir trabajando como Ae. albopictus cepa ligada a M. Líneas adicionales ligadas a M marcadas con OpIE2-GFP o Pub-DsRed que no muestran recombinación hasta la fecha, que llevan un sitio attP de acoplamiento para la transgénesis posterior y que representan GSS adicionales también se mantienen hasta la fecha, pero no se caracterizaron más en detalle.

Primero intentamos obtener un marcador de fluorescencia ligado a m mediante la detección a través de> 120 inserciones aleatorias de piggyBac. Para ello, analizamos nuestra colección existente de Ae. albopictus para enlace m/M y construyó una biblioteca adicional de construcciones piggyBac que expresan varias proteínas de fluorescencia (eGFP, mTurquoise2, YFP o DsRed) bajo el control de promotores que muestran distintos patrones de expresión (3xP3, OpIE2, Ae. aegypti PUb, Drosophila actina5C de melanogaster). Al realizar inyecciones múltiples de estos plásmidos piggyBac juntos, obtuvimos líneas que portaban hasta seis inserciones distintas según lo indicado por sus colores y patrones de fluorescencia. De 40 individuos transgénicos fundadores independientes examinados (la mayoría de los cuales llevaban múltiples inserciones), sólo dos inserciones parecían ligadas a m: una llevaba un gen marcador OpIE2-mTurquoise2 con una tasa de recombinación de aproximadamente el 3%, y la otra, llamada m-albR9. , portaba un transgén Cas9 con un gen indicador DsRed y mostró una tasa de recombinación del 0,1%. Explotamos este último, en el que los transgenes están flanqueados por dos sitios lox adyacentes a un sitio de acoplamiento attP. Inyectamos huevos m-albR9 con un plásmido que codifica la recombinasa Cre para eliminar los transgenes Cas9 y DsRed, ya que Cas9 no es deseable en un GSS. A partir de individuos extirpados con éxito, establecimos una línea de acoplamiento attP ligada a m, mX1, que no transporta más transgenes. En un segundo paso, se integró en el sitio attP un plásmido que contenía attB que llevaba un casete marcador PUb-eGFP. El enlace m de esta nueva cepa se verificó cruzando machos eGFP con hembras WT y examinando a su descendencia. La nueva Ae. La línea ligada a m de albopictus, denominada Aal-m, se hizo hemi/homocigota y se amplificó.

La clasificación automatizada de larvas L1 dependiendo de su nivel de fluorescencia se realizó utilizando un citómetro de flujo de objetos grandes llamado Analizador y clasificador paramétrico de objetos complejos (COPAS SELECT; Union Biometrica, Bélgica) como se publicó16, con el software Biosort proporcionado. La precisión de la clasificación se controló con un microscopio de fluorescencia Nikon SMZ18.

Para determinar el número exacto de larvas en los grupos de COPAS, creamos un algoritmo de agrupamiento basado en la detección manual de valores atípicos del tamaño de las partículas y la distribución de fluorescencia, y un algoritmo de agrupamiento automatizado. Todo el manejo de datos y los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico R versión 4.1.048. Todos los scripts R utilizados para este proyecto se pueden encontrar en Zenodo49. Brevemente, el usuario filtró los datos brutos de COPAS mediante el examen visual de las medidas de tamaño de los individuos (es decir, “log(EXT)” y “log(TOF)”) para eliminar valores atípicos (por ejemplo, restos de huevos y polvo). Se realizó un segundo filtrado en los dos primeros ejes de un Análisis de Componentes Primarios (PCA) aplicado a las variables de tamaño (EXT y TOF). Se aplicó un tercer filtro manual mediante el examen de la fluorescencia de los individuos (es decir, "log (primera fluorescencia)" y "log (segunda fluorescencia)"). Se realizó un filtrado final en los dos primeros ejes de un PCA aplicado a variables de fluorescencia. Los análisis de PCA se realizaron utilizando la función R 'prcomp' del paquete 'stat'48 y los resultados de PCA se extrajeron utilizando el paquete R 'factoextra'50. Los datos filtrados se agruparon utilizando la función R 'kmeans' del paquete R 'stat'48. Los datos se trazaron utilizando los paquetes R 'ggplot2' y 'ggpubr'51,52.

El ADN genómico se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN NEB Monarch HMW (T3060, New England Biolabs, Francia) según las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones: después de la adición de isopropanol, el ADN precipitado se recogió directamente en la punta de una pipeta y se transfirió a un tubo nuevo que contenía 550 µl de tampón de lavado y luego a un tubo final que contiene etanol al 70%. El ADN se almacenó en etanol al 70% a 4 °C hasta su uso. El día de su uso, se eliminó el etanol y el ADN se resuspendió en agua a 37°C con agitación a 500 rpm y pipeteo suave. Luego se midió la concentración de ADN utilizando un dispositivo Nanodrop One (Ozyme, Francia).

El método de secuenciación se adaptó de la secuenciación dirigida Nanopore Cas9 (nCATS)53. Los ARNg se seleccionaron en la región transgénica conocida y se determinaron sus PAM hacia la secuencia genómica desconocida. Esta orientación aseguró la ligadura preferencial de adaptadores Nanopore en cadenas de ADN de interés.

La ligadura del adaptador y la preparación de la biblioteca se realizaron utilizando el kit LSK109 (Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La biblioteca se cargó en celdas de flujo Flongle. La secuenciación, la llamada de bases y la alineación de las lecturas con el plásmido de transgénesis se realizaron utilizando el software MinKNOW v. 21.06.10 proporcionado (Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido). Las lecturas que mostraron homología con los extremos del transposón se alinearon con la secuencia del transposón utilizando ClustalW en el software Geneious v9.1.854 y se determinaron una o varias secuencias consenso. Finalmente, las secuencias consenso se compararon con datos genómicos utilizando el servicio NCBI BLAST en línea55.

Este método nos permitió determinar el sitio de inserción del transgén Aal-m. Obtuvimos solo dos lecturas de baja calidad que se extendieron aproximadamente 20 kb en la secuencia genómica adyacente al transgén, a partir de las cuales diseñamos una serie de cebadores de PCR. La secuenciación de Sanger de los productos de PCR que abarcan la unión transposón/genómica nos permitió refinar 1647 pb de la secuencia flanqueante, proporcionada en los Datos complementarios 1. El análisis de esta secuencia utilizando NCBI BLAST mostró solo una alineación parcial con las secuencias del genoma de AalbF232, presumiblemente correspondiente a un elemento repetitivo, lo que sugiere que la región ligada a m donde se insertó el transgén no está representada en los ensamblajes genómicos disponibles.

En líneas transgénicas, la proporción de sexos se midió mediante recuento COPAS de las larvas de cada fluorescencia. En líneas no transgénicas (BiA y Bra), criamos muestras hasta la etapa de pupa y contamos machos y hembras bajo un microscopio binocular basado en el examen de los genitales. Se realizaron N = 3 réplicas biológicas para todas las líneas.

Para determinar la fecundidad, a los machos y las hembras se les permitió aparearse durante varios días. Luego se les ofreció a las jaulas comida de sangre y se seleccionaron hembras hinchadas. Después de 2 días, las hembras hinchadas fueron anestesiadas brevemente con CO2 y colocadas individualmente en placas de 24 pocillos recubiertas con papel de filtro húmedo durante 2 días. Luego se liberaron las hembras y se fotografió cada pocillo con un microscopio binocular Zeiss SteREO. Los huevos puestos por cada hembra se contaron utilizando el software ImageJ56.

La tasa de eclosión de huevos se midió en muestras de huevos recolectadas de N = 3 a 5 jaulas de cada línea, se fotografiaron con un microscopio binocular Zeiss SteREO y se contaron utilizando el software ImageJ56. Los huevos se sumergieron en agua, se colocaron en una cámara de vacío durante 20 a 30 minutos y se dejaron eclosionar durante la noche. A la mañana siguiente, COPAS contó las larvas.

La supervivencia de larvas a adultos se midió clasificando N = 4 a 8 muestras de 100 a 200 larvas L1 mediante COPAS y criándolas hasta la edad adulta. El número de adultos que surgieron de cada lote se contó manualmente.

La competitividad de los machos se evaluó colocando 30 machos transgénicos con 30 machos no transgénicos en una jaula con 30 hembras y midiendo la proporción de progenie transgénica en su descendencia. Si ambos tipos de machos tienen una aptitud física similar, se espera que la progenie esté compuesta por ~25% de individuos transgénicos (los padres transgénicos son homocigotos), corregido por la proporción de sexos de la línea. La competitividad relativa se estimó comparando la proporción observada de progenie transgénica con el valor teórico en N = 4 o N = 5 réplicas.

La capacidad de vuelo de los machos se evaluó utilizando un dispositivo de prueba de vuelo (FTD) como se describe33. Las pruebas se realizaron en grupos de aproximadamente 100 machos con N = 3 réplicas para cada condición. Se colocaron grupos de machos en una copa hermética en el fondo de varios tubos verticales coronados por un ventilador. Para escapar de la taza apretada, tienen que subir por los tubos verticales contra el flujo de aire causado por el ventilador. Después de dos horas, se contó el número de machos que escaparon frente al número de los que no y se compararon las tasas de escape entre cepas.

La supervivencia de los machos a las 2 semanas se midió contando el número diario de muertes en N = 4–8 jaulas de ~100 machos de cada línea durante 14 días.

Los análisis de rentabilidad se realizaron comparando los resultados de la 'HOJA DE CÁLCULO INTERACTIVA DE LA FAO/OIEA PARA EL DISEÑO DE INSTALACIONES DE CRIATURA EN MASA Y MANEJO DE MACHOS DE MOSQUITOS'34 para diferentes objetivos de producción semanales con los de sus versiones adaptadas teniendo en cuenta el uso de uno o dos GSS. GSS combinado para clasificar machos no transgénicos (ver esquema en Datos complementarios 3). Brevemente, estas nuevas hojas de cálculo se diseñaron de manera similar a la original, pero incorporan la estructura específica de GSS desarrollada previamente en moscas de la fruta que incluye filtros separados y colonias de cría36. En las colonias filtrantes, las larvas del primer estadio se clasifican mediante COPAS y se clasifican una vez más en el estado de pupa mediante un clasificador de pupas clásico. Estas colonias producen los huevos que alimentan a las colonias en cría en cada generación. En un escenario GSS único, la colonia de cría se clasifica como L1 para producir los machos que se liberarán. En un escenario GSS-CS, dos colonias filtrantes separadas producen los huevos para su respectiva colonia de cría, que a su vez se clasifican y aparean para producir los huevos que eclosionarán y se clasificarán por sexo como L1 para liberaciones exclusivas de machos. En estos escenarios, se utilizan colonias filtrantes en cada generación, lo que es más cuidadoso que lo que se hace en las moscas de la fruta a pesar de una mayor tasa de recombinación36. Los parámetros de entrada se pueden leer en los Datos complementarios 3. Es de destacar que los costos mencionados en la hoja de cálculo se implementaron en euros (€) y se actualizaron en julio de 2022. Estos costos son observaciones promedio de los ensayos SIT europeos y fueron revisados ​​por investigadores de la OIEA. Para facilitar los análisis posteriores, estas hojas de cálculo de Excel se tradujeron a una función R48. Esta función utiliza funciones comunes de R-base48, así como funciones de los paquetes 'purrr' y 'tidyverse'57. Fue depositado permanentemente en Zenodo49. Los costos de producción se convirtieron en dólares estadounidenses ($).

Todos los análisis estadísticos de datos se realizaron utilizando el software estadístico R versión 4.1.048; los scripts R utilizados para este estudio se pueden encontrar en Zenodo49.

La diferencia de la proporción de sexos y la tasa de eclosión de huevos entre las líneas de cada especie se modeló utilizando el modelo generalizado con distribución binomial y supuesto de normalidad de la distribución de residuos (función R 'glm'48), y la comparación por pares de las líneas se probó utilizando un Tukey HSD. prueba (función R 'glht'58). La diferencia en fecundidad (número de huevos puestos por hembra) entre las líneas de cada especie se modeló utilizando un modelo de obstáculos con una distribución binomial negativa. La importancia del modelo de obstáculos se obtiene en dos partes: la primera parte es la probabilidad de alcanzar el valor 0 y la segunda parte es la probabilidad de valores distintos de cero. Las diferencias en la supervivencia larvaria entre las líneas de cada especie se modelaron utilizando modelos lineales con el supuesto de normalidad de la distribución de residuos (función R 'lm'48) y se probaron utilizando una prueba Tukey HSD (función R 'TukeyHSD'48). La diferencia en la competitividad masculina y la capacidad de vuelo entre las líneas de cada especie se modeló utilizando el mod generalizado de efecto mixto con distribución binomial y supuesto de normalidad de distribución de residuos (función R 'glmer' del paquete 'lme4'59), donde se realizaron réplicas técnicas. establecer como factor aleatorio. Las comparaciones por pares entre líneas se probaron utilizando una prueba Tukey HSD (función R 'glht'). La supervivencia de los adultos masculinos durante los primeros 14 días se modeló utilizando regresiones de Cox y la fórmula de Kaplan-Meir (función de los paquetes R 'survminer', 'survival'60,61,62). Las diferencias en la supervivencia a los 7 y 14 días se modelaron utilizando modelos lineales con el supuesto de normalidad de la distribución de residuos (función R 'lm') y se probaron utilizando una prueba Tukey HSD (función R 'TukeyHSD'). El rendimiento del modelo se evaluó utilizando la función R 'check_model' del paquete 'rendimiento'63. Los paquetes utilizados, los procedimientos de manejo de datos, la estructura del modelo, el ajuste y el rendimiento se pueden encontrar en los Datos complementarios 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todas las secuencias de plásmidos están disponibles en los Datos complementarios 4. Los plásmidos están disponibles en Addgene con los números de referencia n.° 173666, n.° 183903, n.° 183904, n.° 183911, n.° 183912, n.° 183913, n.° 183914 y n.° 183966. Las cepas de mosquitos están disponibles a pedido de EM. Los datos de origen para generar los gráficos de las Figs. 3 y 4 se proporcionan en los Datos complementarios 2. Los datos de origen para la Fig. 5 se proporcionan en los Datos complementarios 3 (sección 'Parámetros iniciales'). Los conjuntos de datos también se pueden descargar desde Zenodo49. Cualquier información restante se puede obtener de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

La función R que replica las cuatro hojas de cálculo, el código de análisis COPAS y el código para replicar nuestros análisis estadísticos están disponibles en Zenodo49. El resto del código utilizado en este estudio está disponible a través de los autores previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al Dr. H. Maiga y al Dr. W. Mamai de la Agencia Internacional de Energía Atómica (Viena, Austria) por la revisión de los costos relacionados con la SIT, a Nathalie Schallon y Amandine Gautier por la operación insectaria, y a la Dra. Stéphanie Blandin por apoyo continuo y discusión científica.

Este estudio fue financiado por la subvención del EU ERC CoG—682387 REVOLINC a JB. El contenido de esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja necesariamente las opiniones de la Comisión Europea. La producción de mosquitos y el funcionamiento del insectario contaron con el apoyo de la subvención n.º ANR-11-EQPX-0022 de la Agence Nationale de la Recherche y el contrato trienal “Strasbourg capitale européenne” 2019-2021. Parte de los experimentos con mosquitos se han realizado en la plataforma del insectario Baillarguet, miembro de la Infraestructura Nacional EMERG'IN y de la red Vectopole Sud (http://www.vectopole-sud.fr/). La plataforma del insectario Baillarguet está liderada por las unidades conjuntas Intertryp (IRD, Cirad) y ASTRE (Cirad, INRAE). EM recibió financiación de la Agence Nationale de la Recherche a través de las subvenciones #ANR-19-CE35-0007 GDaMO y # 18-CE35-0003-02 BAKOUMBA. RB contó con el apoyo del Grupo Internacional de Formación en Investigación TreeDì, financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación)—319936945/GRK2324. OSA recibió el apoyo de premios NIH (R01AI151004, 5R21AI156018, 5RO1AI148300).

Todas las figuras fueron diseñadas en BioRender.com bajo licencia paga.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Jérémy Bouyer, Eric Marois.

CIRAD, UMR ASTRE, F-34398, Montpellier, Francia

Célia Lutrat, Thierry Baldet y Jérémy Bouyer

ASTRE, CIRAD, INRA, Univ. Montpellier, Montpellier, Francia

Celia Lutrat

Universidad de Montpellier, Montpellier, Francia

Celia Lutrat

CNRS UPR9022, INSERM U1257, Universidad de Estrasburgo, Estrasburgo, Francia

Celia Lutrat, Myriam Burckbuchler, Roenick Proveti Elm y Eric Marois

Centro Alemán para la Investigación Integrativa de la Biodiversidad (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, Puschstrasse 4, 04103, Leipzig, Alemania

Rémy Bougnon

Instituto de Biología, Universidad de Leipzig, Puschstrasse 4, 04103, Leipzig, Alemania

Rémy Bougnon

Unidad de Parasitología y Entomología, Departamento de Microbiología y Enfermedades Infecciosas, Instituto de Investigaciones Biomédicas del Ejército (IRBA), Marsella, Francia

Albin Fontaine

Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Universidad de California, San Diego, CA, 92093, EE. UU.

Omar S. Akbari

Cicindela Ltd, Valencia, España

Rafael Argilés-Herrero

CIRAD, UMR ASTRE, Sainte-Clotilde, F-97490, Reunión, Francia

Thierry Baldet

CIRAD, UMR ASTRE, Saint-Pierre, F-97410, Reunión, Francia

Jérémy Bouyer

Subprograma de lucha contra las plagas de insectos, División Mixta FAO/OIEA de Técnicas Nucleares en la Alimentación y la Agricultura, Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA), Viena (Austria)

Jérémy Bouyer

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CL, TB, JB y EM diseñaron investigaciones. La FA contribuyó a los datos genómicos. CL, MB, RPO y EM realizaron investigaciones. Datos analizados de CL, RPO, RB, AF, OSA, RAH y EM. RB y RAH contribuyeron con herramientas analíticas. CL escribió el artículo con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Célia Lutrat o Eric Marois.

OSA es cofundador de Agragene, Inc. y Synvect, Inc. con participación accionaria. Los términos de este acuerdo han sido revisados ​​y aprobados por la Universidad de California, San Diego, de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Apoyamos la realización de investigaciones inclusivas, diversas y equitativas. El cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices del CNRS y aprobado por el comité de ética de CREMEAS.

Communications Biology agradece a Nikolai Windbichler, Benjamin Matthews y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Anam Akhtar y Gene Chong. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Lutrat, C., Burckbuchler, M., Olmo, RP et al. La combinación de dos cepas de sexado genético permite seleccionar machos no transgénicos para el control genético de Aedes. Común Biol 6, 646 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05030-7

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Recibido: 22 de febrero de 2023

Aceptado: 08 de junio de 2023

Publicado: 16 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05030-7

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