Control de la herencia de plástidos por factores ambientales y genéticos.

Nature Plants volumen 9, páginas 68–80 (2023)Cite este artículo

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Los genomas de los orgánulos citoplasmáticos (mitocondrias y plastidios) se heredan por vía materna en la mayoría de los eucariotas, excluyendo así los genomas de los orgánulos de los beneficios de la reproducción y la recombinación sexual. Los mecanismos subyacentes a la herencia materna se desconocen en gran medida. Aquí demostramos que dos mecanismos que actúan de forma independiente garantizan la herencia materna del genoma del plástido (cloroplasto). Al realizar exámenes genéticos a gran escala para la transmisión de plastidios paternos, descubrimos que el estrés por frío leve durante la gametogénesis masculina conduce a una mayor entrada de plastidios paternos en los espermatozoides y a un fuerte aumento de la transmisión de plastidios paternos. Además, mostramos que la herencia de los genomas de los plástidos paternos está controlada por la actividad de una exonucleasa que degrada el genoma durante la maduración del polen. Nuestros datos revelan que (1) la herencia materna se rompe en condiciones ambientales específicas, (2) un mecanismo de exclusión de orgánulos y un mecanismo de degradación del genoma actúan en conjunto para prevenir la transmisión paterna de genes de plastidios y (3) la herencia de plastidios está determinada por genes complejos. interacciones del entorno.

Los genomas citoplasmáticos se heredan por vía materna en la mayoría de los eucariotas1,2. En general, se cree que la herencia uniparental de los orgánulos y sus genomas los convierte en sistemas genéticos de reproducción asexual3,4,5. Se espera que la falta de recombinación sexual conduzca a la eventual fusión mutacional de los genomas de los organelos, un fenómeno ampliamente conocido como trinquete de Muller6,7,8. Esto se debe a la acumulación de mutaciones perjudiciales que no pueden separarse de las mutaciones beneficiosas (que ocurren raramente) y que pueden considerarse como un caso de "autostop genético"9. Si bien debe haber fuerzas evolutivas que expliquen la fuerte prevalencia de la herencia uniparental, también debe haber mecanismos compensatorios que permitan a los genomas orgánulos escapar del colapso mutacional.

En las plantas, los dos genomas orgánulos (plastidios y mitocondrias) tienen tasas de mutación más bajas que los genomas nucleares10,11. Las bajas tasas de mutación reducen el autostop genético y, por tanto, ralentizan el trinquete de Muller8. Recientemente, se ha propuesto la vigilancia temprana de mutaciones y la inducción de la reparación por recombinación (dependiente de la proteína MSH1) como parte de una explicación mecanicista de las bajas tasas de mutación en los orgánulos de las plantas12. Sin embargo, si bien las bajas tasas de mutación pueden ralentizar el trinquete de Muller, no pueden impedir por completo que gire. Además, existen taxones de plantas excepcionales, como Plantago, Silene y Pelargonium, donde las tasas de mutación del genoma organelar son muy elevadas13,14,15,16. En conjunto, estas observaciones y consideraciones sugieren que probablemente se necesiten mecanismos adicionales para prevenir la fusión mutacional en las plantas.

Además de las bajas tasas de mutación, los episodios de herencia biparental de orgánulos también podrían contrarrestar el trinquete de Muller. La transmisión biparental de orgánulos que pueden fusionarse (como las mitocondrias de las plantas) les permitiría participar en el sexo y la recombinación, proporcionando así la capacidad de generar genomas con combinaciones favorables de mutaciones y reducir el autostop genético. Aunque la fusión de los plástidos de las plantas con semillas rara vez se observa17,18,19, la herencia biparental podría ayudar a resolver conflictos citonucleares20, permitir la captura del genoma de los plástidos21,22 y contribuir a la evolución adaptativa23,24.

Aunque la herencia materna es la regla general, la herencia biparental estable ha surgido varias veces de forma independiente en la evolución tanto de animales como de plantas25,26,27,28,29. Por ejemplo, las plantas con semillas Medicago y Pelargonium muestran una transmisión biparental frecuente27,30. Además, incluso en especies de plantas con herencia principalmente materna como el tabaco (Nicotiana tabacum) y Arabidopsis thaliana, se ha documentado la transmisión ocasional de plastidios a través del polen ('fuga paterna'), aunque con frecuencias muy bajas31,32. Se desconocen por completo las razones y las fuerzas selectivas que han dado forma a la herencia de orgánulos uniparentales (al mismo tiempo que permiten fugas paternas ocasionales), así como las fuerzas que impulsan los interruptores evolutivos en el modo de herencia de orgánulos.

Se han descrito varios mecanismos citológicos que contribuyen a la herencia materna de los plastidios sobre la base de observaciones microscópicas. Estos incluyen (1) exclusión de plastidios de la célula generativa en la mitosis del polen I (PMI), (2) degradación de plastidios y/o su ADN durante la maduración del polen y (3) eliminación de plastidios paternos durante la fertilización33,34. Los mecanismos moleculares implicados en estos procesos no se conocen bien. En Drosophila, una nucleasa (endonucleasa G) degrada el ADN mitocondrial paterno tras la fertilización35. En las plantas, dos loci nucleares no identificados se asociaron con patrones de herencia de plastidios en Pelargonium36 pero hasta ahora no se ha identificado ni un solo gen implicado en la determinación del modo de herencia citoplasmática en las plantas con semillas. Además, no se ha explorado el posible impacto de los factores ambientales en el modo de herencia de los plástidos.

Como se espera que la herencia biparental afecte profundamente la estabilidad y evolución del genoma organelar, decidimos estudiar los determinantes de la herencia citoplasmática. Para ello, nos propusimos identificar los factores ambientales y genéticos que determinan la herencia de los plástidos en la planta modelo de tabaco.

Para analizar el efecto de los factores ambientales en la herencia del genoma orgánulo, empleamos un procedimiento de detección genética sensible para detectar y cuantificar eventos de entrada de plastidios paternos al cigoto (Fig. 1a). El cribado se basa en la incorporación del gen de resistencia a los antibióticos aadA (que confiere resistencia a la espectinomicina) y el gen informador gfp (que codifica la proteína verde fluorescente, GFP) en el genoma del plástido de la planta modelo de tabaco (Nicotiana tabacum31,37; Fig. 1b). . La espectinomicina es un inhibidor específico de la biosíntesis de proteínas en el cloroplasto y su aplicación a plántulas de tipo silvestre produce detención del crecimiento y pérdida de pigmento. La transmisión biparental por plastidios se puede detectar polinizando plantas de tipo salvaje (como receptoras maternas) con polen de plantas que contienen el gen marcador aadA en su genoma de plastidios (como padre transplastómico). La entrada de los plastidios paternos al cigoto se puede visualizar fácilmente germinando semillas en presencia de espectinomicina porque las células que reciben genomas de plastidios paternos son resistentes al fármaco y permanecen verdes, lo que da como resultado plántulas abigarradas de color verde y blanco (Fig. 1a, c). .

a, Cribado genético para la transmisión paterna por plastidios. (i) Al inicio de la floración, las plantas transplastómicas (WTptGFP) se exponen a estrés abiótico para que el gametofito masculino se desarrolle bajo estrés. (ii) Las plantas cultivadas en invernadero con plastidios de tipo salvaje se fertilizan con polen de plantas WTptGFP estresadas. (iii) Las semillas se siembran en un medio que contiene espectinomicina. Las plántulas que heredaron plastidios paternos muestran sectores verdes (resistentes a espectinomicina)31. b, Mapas físicos de los genomas de plástidos maternos (tipo salvaje, WT) y paternos (transplastómicos, ptGFP). El genoma del plástido paterno alberga dos transgenes: aadA (marcador de resistencia) y gfp (reportero). Se indican promotores, terminadores (ambos azules) y sitios de restricción relevantes. La barra negra representa una sonda de hibridación para RFLP. c, Transmisión paterna por plastidios detectada mediante selección con espectinomicina. Arriba a la izquierda: las puntas de flecha indican plántulas con sectores verdes. Arriba a la derecha: imagen ampliada de un sector verde. Abajo: plántulas con sectores verdes que muestran fluorescencia tanto de GFP (izquierda) como de clorofila (Chl, derecha). Barra de escala, 1 mm. d, Tasas de transmisión de plastidios paternos bajo estrés. Los círculos representan proporciones de plántulas que tienen sectores verdes positivos para GFP por cosecha (unidad de replicación, ver Métodos); los círculos en el eje x significan que no se encontró transmisión paterna. Se compararon las tasas de transmisión de plantas estresadas y no tratadas31, lo que representa el 'Experimento 1' (Tabla 1). Los efectos del tratamiento (β) se estimaron utilizando el Modelo 1 (nrep.total = 16 cosechas, ~4,35 millones de plántulas; Tablas de datos ampliados 1 y 2) y se probaron mediante pruebas z de Wald simultáneas de dos colas. α = 0,05; NS, P > 0,05, ***P < 0,001. Sólo el tratamiento de enfriamiento tiene un efecto significativo (P = 1,22 × 10-101). Los valores de β representan cambios en veces en log10. Las medias por tratamiento se muestran en líneas horizontales negras, con CI95 en cuadros de colores. e, análisis RFLP de líneas PPI seleccionadas: HL1, luz alta; H1, calor; D6, sequía; C111, C116, C200, enfriamiento. El análisis RFLP con EcoRV y XhoI (cf. panel b) produce fragmentos de 4,7 kb para plastidios paternos y 3,2 kb para plastidios maternos (WT). La transferencia es representativa de tres experimentos independientes. f, Localización de la fluorescencia de GFP en cloroplastos. La fluorescencia de GFP y la superposición con fluorescencia de Chl se muestran para WT, WTptGFP transplastómico y una línea PPI. Las imágenes son representativas de cien líneas PPI independientes analizadas. Barra de escala, 10 µm.

Datos fuente

Utilizando este sistema experimental, aplicamos condiciones de estrés abiótico leve que ocurren comúnmente en la naturaleza: calor, sequía, frío y estrés lumínico. Como la herencia materna generalmente se establece mediante exclusión y/o degradación de orgánulos durante la gametogénesis masculina33,38, las condiciones de estrés se aplicaron específicamente durante el desarrollo del polen (Fig. 1a). Para este fin, las plantas cultivadas en condiciones de crecimiento estándar se transfirieron a estrés lumínico elevado a 1000 µE m-2 s-1, estrés por sequía (reteniendo agua hasta que se produjera un marchitamiento visible), estrés por calor a 35 °C o estrés por frío a 10 °C. C después de haber formado botones florales (Datos ampliados, Fig. 1). Una vez completado el desarrollo del polen, se utilizó polen maduro de plantas estresadas para fertilizar flores de plantas no estresadas. Se realizaron cruces a gran escala para las cuatro condiciones de estrés y para condiciones estándar en ausencia de estrés ambiental31. Para cada condición de estrés, se produjeron entre 472.000 y 727.000 semillas (Cuadro 1).

Las semillas fueron germinadas en presencia de espectinomicina (a la que sólo el genoma plastidio del padre confiere resistencia), y las plántulas con sectores verdes fueron identificadas mediante inspección visual y observación bajo el estereomicroscopio. Para distinguir los eventos de transmisión paterna de las células espontáneas resistentes a la espectinomicina (que ocasionalmente aparecen), todos los sectores verdes detectados se examinaron mediante microscopía UV para probar la expresión de la proteína indicadora fluorescente GFP en los plastidios (Fig. 1c).

El análisis de la progenie obtenida mediante fertilización con polen de plantas con alto estrés lumínico, estrés por sequía y estrés por calor reveló que todos estos cruces mostraron niveles similares de fuga paterna muy baja a los cruces de control sin estrés31 (Tabla 1 y Tablas de datos ampliados 1). y 2). Por el contrario, las plántulas obtenidas de cruces con polen de plantas estresadas por frío mostraron niveles muy elevados de herencia biparental (Fig. 1d y Tabla 1). De 479.230 descendientes analizados, 1.151 plántulas heredaron genomas de plástidos paternos, lo que corresponde a una frecuencia de transmisión biparental del 0,24% (Tabla 1). Esta frecuencia representa un aumento >150 veces en la tasa de transmisión de plastidios paternos en comparación con el control sin estrés (Tabla 1).

La regeneración de sectores verdes en plantas en presencia de espectinomicina dio como resultado plantas uniformemente verdes (denominadas líneas PPI-C para la herencia de plastidios paternos bajo estrés por frío) que se analizaron mediante transferencia Southern para confirmar directamente la presencia de los genomas de plastidios paternos. El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) reveló que todas las líneas contenían el ADN del plástido paterno (Fig. 1e). La microscopía confocal de barrido láser confirmó que los plastidios eran los sitios de fluorescencia de GFP (Fig. 1f).

La frecuencia medida de herencia de plastidios biparentales bajo estrés por frío debe ser lo suficientemente alta como para identificar eventos de transmisión paterna en ausencia de selección de antibióticos, mediante el análisis aleatorio de una cantidad suficientemente grande de plántulas cultivadas en condiciones no selectivas. Cuando se analizaron 8.334 plántulas cultivadas en medio libre de espectinomicina para determinar la expresión de GFP, 9 plántulas mostraron una clara fluorescencia de GFP y 4 tenían un meristemo apical de brote fluorescente (Datos ampliados, figura 2). Este resultado confirma la alta tasa de transmisión biparental medida en el experimento de selección de espectinomicina bajo estrés por frío (Tabla 1) y, lo que es más importante, demuestra que el proceso de selección no influye en la detección de eventos de transmisión paterna.

La transferencia posterior de plántulas que muestran sectores fluorescentes y/o meristemas a un medio que contiene espectinomicina resultó en el blanqueamiento de las células que contienen solo plastidios maternos40 y, por lo tanto, visualizó directamente la presencia de plastidios paternos heredados (Datos ampliados, Fig. 2c).

Dado que la baja temperatura altera en gran medida el modo de herencia de los genomas de los plastidios, nos propusimos investigar el efecto del estrés por frío en el destino de los plastidios paternos en la gametogénesis. Durante la gametogénesis masculina, tiene lugar una división celular altamente asimétrica en la mitosis del polen I (PMI; Fig. 2a). Estudios anteriores sugirieron que todos (o la gran mayoría de) los plastidios paternos están excluidos de la célula generativa (GC) más pequeña, lo que resulta en una herencia de plastidios maternos33,34. Para probar si el estrés por frío tiene un impacto directo en este proceso, examinamos el efecto de la baja temperatura en la segregación de plástidos paternos durante la maduración del polen. Con este fin, se investigaron dos etapas en el desarrollo del polen mediante microscopía confocal de barrido láser utilizando una línea transplastómica que expresa el indicador fluorescente DsRed dentro de los plastidios (Fig. 2b): el polen binucleado temprano (EBP, el producto de PMI) y el polen temprano. etapa del tubo polínico (EPT; Fig. 2a). La detección del reportero DsRed indicó que los plástidos de polen son capaces de expresar transgén activamente (Fig. 2c).

a, Diagrama esquemático de la maduración del polen en el tabaco. Se cree que la exclusión de plastidios ocurre en la mitosis I del polen mediante una división celular fuertemente asimétrica, lo que impide la entrada de la gran mayoría de plastidios al GC en EBP. VC, célula vegetativa; GCN, núcleo celular generativo; VCN, núcleo de células vegetativas. b, Mapa de la región que contiene el transgén en el genoma del plástido ptDsRed, que alberga el casete de expresión de DsRed y el gen de resistencia a espectinomicina aadA. Los elementos de expresión (promotores, terminadores y sitios de unión a ribosomas, RBS) se indican en azul. c, Imágenes confocales de EBP en plantas WTptDsRed. El CCW (gris) formado transitoriamente después de PMI se visualiza mediante tinción con azul de anilina (puntas de flecha). La flecha abierta apunta a un plastidio (magenta) incluido en el GC en polen desarrollado a 10 °C. Este experimento se repitió cuatro veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 10 μm. d, Imágenes confocales de lapso de tiempo de EPT en germinación in vitro que expresan DsRed en plastidios. El GCN (verde) se visualiza mediante tinción con SYTO11. La membrana del GC está indicada por una línea de puntos. Las puntas de flecha y los asteriscos indican plastidios (magenta) ubicados dentro o fuera del GC, respectivamente. Este experimento se repitió diez veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 5 μm. e, Proporción de granos de polen con plastidios incluidos en el GC. Cada círculo muestra la proporción de GC que contienen plastidios en una sesión/réplica de imágenes (Tabla de datos ampliados 3). Las diferencias entre los grupos experimentales están representadas por los valores de los parámetros (β) expresados ​​como log10 del cambio y se estimaron utilizando un modelo binomial (Modelo 2, nrep.total = 18 sesiones de imágenes, 301 granos analizados; Tablas de datos ampliados 1 y 2) : βchilling representa el efecto del tratamiento de enfriamiento (P = 6.01 × 10−5); El experimento β representa las diferencias entre los experimentos EPT (P = 0,0288) y EBP (Tabla de datos ampliados 2). Las estimaciones medias y el CI95 por grupo experimental se muestran en líneas horizontales negras y cuadros de colores, respectivamente. Los parámetros se probaron utilizando pruebas z de Wald de dos colas simultáneas. *P < 0,05; ***P < 0,001; α = 0,05.

Datos fuente

El GC recién formado en la EBP está unido por una pared celular de callosa (CCW) que se forma transitoriamente después de PMI y puede visualizarse mediante tinción con azul de anilina (Fig. 2a). El crecimiento a baja temperatura (10 °C) retrasó el desarrollo floral y del polen, redujo la viabilidad del polen y ocasionalmente causó patrones aberrantes de división celular (Datos ampliados, Fig. 3). El análisis microscópico confocal de EBP a temperatura ambiente versus baja reveló que, a 10 °C, la forma del GC es irregular y los plastidios se incluyen con mayor frecuencia en el citoplasma del GC (Fig. 2c,e y Tabla de datos ampliados 3; para reconstrucciones tridimensionales de polen representativo, ver videos complementarios 1 y 2).

Para probar si los plastidios persisten en etapas posteriores del desarrollo del polen, se analizaron GC en el tubo polínico tras la germinación (EPT; Fig. 2a) mediante microscopía confocal de lapso de tiempo in vivo. Los datos revelaron que los plastidios incluidos en el GC durante el PMI en condiciones de frío todavía estaban presentes durante la migración del GC al tubo polínico (Fig. 2a, d y video complementario 3), lo que probablemente contribuyó al aumento sustancial de la transmisión de plastidios paternos a baja temperatura ( Fig. 2e y tablas de datos ampliados 1–3).

Es importante tener en cuenta que el aumento observado en la entrada de plastidios paternos en el GC es insuficiente para explicar completamente el aumento de> 150 veces en la transmisión de plastidios paternos inducida por frío (ver Figs. 1d y 2e). Por lo tanto, además de la división celular y la distribución de los orgánulos, el enfriamiento probablemente afecta otros procesos celulares que son relevantes para la herencia de los orgánulos. Como la baja temperatura también reduce las actividades de todas las enzimas en la célula, consideramos enzimas candidatas que podrían estar involucradas en la herencia de los plástidos y cuya actividad reducida a 10 °C puede explicar potencialmente el aumento en la transmisión paterna que sigue sin explicarse por la distribución de los orgánulos en PMI solo.

Durante la gametogénesis masculina, el ADN plástido se degrada activamente y la exonucleasa AtDPD1 juega un papel clave en este proceso en Arabidopsis thaliana41. Hasta el momento, no se ha demostrado que AtDPD1 afecte la herencia materna41 y, en cambio, se ha sugerido que facilita la movilización de fosfato del ADN plástido en condiciones de falta de fósforo42. Habiendo visto que la baja temperatura promueve la inclusión de plastidios en el GC, planteamos la hipótesis de que escapar de la degradación del genoma también puede mejorar la tasa de transmisión del genoma de los plastidios paternos. Para probar esta idea, nos propusimos producir un mutante knockout para dpd1 en el tabaco mediante edición del genoma. El tabaco (N. tabacum) es una especie alotetraploide que comprende los genomas de dos especies diploides, N. sylvestris y N. tomentosiformis, por lo que requiere la generación de una eliminación tetraalélica (Fig. 3a, by Datos ampliados, Fig. 4). La orientación de los alelos dpd1 en ambos subgenomas mediante la edición CRISPR/Cas9 con sgRNA (RNA guía única) diseñados apropiadamente permitió el aislamiento de un mutante nulo de dpd1 (ver Métodos, Fig. 3a, by Datos ampliados Fig. 4).

a, Mapas de transcripción de homeólogos de DPD1. N. tabacum alberga dos genes DPD1: NtDPD1S y NtDPD1T (regiones codificantes en azul y naranja, respectivamente). líneas negras, intrones; cajas, exones; color oscuro, dominio exonucleasa conservado; Líneas discontinuas, sitios objetivo de los sgRNA L y R. b, Secuencias genómicas de loci de tipo salvaje de DPD1 (arriba) y de un mutante de dpd1 generado usando CRISPR/Cas9 (abajo). Las secuencias PAM están subrayadas. Los tonos amarillos denotan bases polimórficas entre homeólogos. ΔΔ simboliza una gran eliminación. c, Imágenes confocales de polen WTptGFP (izquierda) y dpd1ptGFP (derecha). UNM y MPG se tiñeron con DAPI para visualizar el ADN nuclear y plástido. Las flechas indican ADN organelar. En los canales fusionados (derecha: ampliación ×4 del área del cuadro de puntos), las puntas de flecha indican señales de fluorescencia DAPI y ptGFP superpuestas. Las imágenes son representativas de tres experimentos. Barra de escala, 10 μm. d, Cuantificación relativa del ADN de plástidos en fracciones de polen enriquecidas de WTptGFP y dpd1ptGFP. Las muestras se midieron por triplicado mediante PCR en tiempo real; Las cantidades medias de ADN de plástidos (amplicón aadA) se normalizaron a cantidades medias de ADN nuclear (amplicón de ADNr 18S). Los valores de dpd1ptGFP (círculos) son relativos a las muestras WTptGFP correspondientes de cuatro réplicas utilizando diferentes plantas. Barras de error, ±sem e, Tasas de transmisión de plastidios paternos entre experimentos. Los círculos representan proporción de plántulas por cosecha que llevan sectores verdes. Los efectos del genotipo y el tratamiento de enfriamiento en los tres experimentos independientes (Tabla 1) se analizaron en el Modelo 3 (nrep.total = 13 cosechas, ~2,65 millones de plántulas; Tablas de datos ampliados 1 y 2). Las barras horizontales negras muestran tasas medias por combinación de genotipo/tratamiento. Se estimaron las tasas por grupo experimental (líneas horizontales de colores) con IC95 (cuadros de colores). Las líneas discontinuas representan la transmisión paterna del plastidio basal (gris) y el máximo teórico (negro). Las estimaciones del efecto se probaron mediante pruebas z de Wald de dos colas simultáneas: genotipo dpd1 (P = 6,22 × 10−35), tratamiento de refrigeración (P = 2,20 × 10−126) y la interacción entre ambos factores (P = 3,17 × 10− 10) fueron significativos. ***P < 0,001, α = 0,05. f, Visualización de la transmisión de plastidios paternos mediante selección de espectinomicina (Experimentos 2 y 3; Tabla 1). Las puntas de flecha azules indican sectores verdes (plastidios paternos). Los recuadros muestran ejemplos ampliados.

De acuerdo con hallazgos previos informados en A. thaliana, el mutante dpd1 del tabaco no muestra un fenotipo de crecimiento vegetativo notable. El crecimiento de las plantas, la transición reproductiva y el desarrollo floral en el mutante dpd1 fueron comparables a las plantas de tipo salvaje (Datos ampliados, Fig. 5a). Sin embargo, se observó una reducción en la viabilidad del polen en el mutante dpd1 (Datos ampliados, Fig. 5b, c). La microscopía de barrido láser confocal y el análisis de PCR cuantitativo revelaron retención de ADN plástido en granos de polen maduros del mutante dpd1 (Fig. 3c, dy Datos ampliados Fig. 5d). Los ensayos de herencia a gran escala mostraron que el mutante dpd1 mostraba niveles muy elevados de transmisión de plastidios paternos a la progenie (Fig. 3e, f y Tabla 1), identificando así la tasa de degradación del genoma de los plastidios como un factor genético que determina el modo de herencia de los plastidios. .

A continuación, queríamos examinar si la acción combinada de los genes y el entorno confiere niveles aún más altos de herencia de plástidos biparentales. Con este fin, evaluamos comparativamente los efectos del estrés por frío en la frecuencia de transmisión de los plastidios paternos en los orígenes genéticos de tipo salvaje y dpd1. De hecho, el desarrollo de polen a baja temperatura en el mutante dpd1 resultó en un aumento de aproximadamente diez veces en la transmisión de plastidios paternos en comparación con el efecto del genotipo dpd1 solo o el del medio ambiente solo (Tabla 1 y Fig. 3e, f). La transmisión paterna de plastidios alcanzó frecuencias entre 2,2% y 3,2% (en dos experimentos independientes; Fig. 3e y Tabla 1). Estos datos muestran que los genes y el medio ambiente actúan sinérgicamente en el control de la herencia de plástidos, y su acción combinada puede dar como resultado niveles sustanciales de herencia biparental (Fig. 3e). También es digno de mención que el factor ambiental baja temperatura y el factor genético dpd1 no son completamente independientes en sus efectos sobre la herencia de plástidos, como lo revela la interacción negativa entre ellos (Fig. 3e).

Los eventos de herencia biparental en los que los plastidios paternos heredados están presentes en el meristemo apical del brote (Datos ampliados Fig. 2b, c y Fig. 4a, b) son particularmente relevantes porque desde allí ingresan a la línea germinal (tras la transición del meristemo apical). en un meristemo floral) y volverse hereditario. Por lo tanto, se realizaron exámenes a gran escala para evaluar cuantitativamente la entrada de plastidios paternos en los meristemas apicales de brotes y raíces en el entorno genético de tipo salvaje y dpd1 bajo temperatura ambiente o estrés por frío. La presencia de plastidios paternos se evidenció por la fluorescencia de GFP en el meristemo (Datos ampliados, Fig. 2b, c) y el crecimiento continuo de la planta en presencia de espectinomicina (Fig. 4a). La presencia de plastidios paternos en el meristemo apical del brote se observó con alta frecuencia, en casi la mitad de los eventos de transmisión biparental en dpd1 bajo estrés por frío (cf. Tabla 1 y Fig. 4b).

a, Imágenes de plántulas con plastidios paternos heredados presentes en el meristemo apical del brote (SAM, puntas de flecha blancas) o en el meristemo apical de la raíz (RAM, flechas blancas), como lo demuestra el crecimiento en presencia de espectinomicina. Barra de escala, 10 mm. b, Cuantificación de la transmisión de plastidios paternos en SAM y RAM. Los datos se obtuvieron de los experimentos de cruce 2 y 3. c, Ensayos de germinación de semillas para confirmar la herencia del plastidio transmitido por vía paterna a la siguiente generación. Se germinaron semillas de una planta WT, una planta WTptGFP transplastómica y una línea con PPI en medio con 500 μg ml-1 de espectinomicina.

Para determinar si los genomas de plastidios paternos heredados pueden mantenerse de manera estable a lo largo de generaciones, se cultivaron en invernadero plantas con plastidios paternos presentes en el meristemo apical del brote y se autopolinizaron para la producción de semillas. La resistencia uniforme de la progenie a la espectinomicina (Fig. 4c) demostró homoplasmia del genoma del plástido (adquirido por el padre), que se hereda por vía materna a la siguiente generación en ausencia de estrés. En conjunto, estos datos muestran que los plastidios heredados por vía paterna ingresan fácilmente a la línea germinal y se transmiten a la siguiente generación, lo que sugiere que el fenómeno descubierto tiene importancia evolutiva para la adaptación43 y, potencialmente, la especiación44.

En el transcurso de este trabajo, hemos descubierto dos factores distintos que determinan conjuntamente la herencia de los plástidos en las plantas. Mientras que el factor ambiental temperatura afecta la distribución de los plástidos durante la división celular asimétrica que ocurre en PMI, el factor genético DPD1 afecta la degradación del genoma organelar durante la gametogénesis masculina (Fig. 5).

Los efectos combinados de dpd1 y la baja temperatura promueven la transmisión de plastidios paternos, lo que resulta en un cambio de la herencia materna a biparental de los plastidios y sus genomas.

Sorprendentemente, la posibilidad de que la herencia de los plástidos esté influenciada por el medio ambiente no se ha considerado previamente. Aquí descubrimos que la herencia materna se rompe cuando la gametogénesis masculina ocurre a baja temperatura. Identificamos el mecanismo subyacente al mostrar que el enfriamiento promueve la inclusión de plastidios paternos en el GC. Se ha demostrado que el estrés por frío produce la desestabilización del citoesqueleto durante la gametogénesis45. La aparición de patrones de división celular alterados en PMI tras la exposición de la planta a bajas temperaturas (Datos ampliados, Fig. 3b) sugiere que la función citoesquelética comprometida es responsable de la exclusión incompleta de los plástidos del GC.

El segundo mecanismo de eliminación descubierto por nuestro trabajo actúa a nivel de estabilidad del genoma orgánulo. La exonucleasa DPD1 degrada los genomas de los orgánulos en el polen en maduración, proporcionando así un mecanismo a prueba de fallos que inactiva genéticamente los plastidios que escaparon del mecanismo de exclusión de orgánulos que opera en PMI. En consecuencia, cuando ambos mecanismos (exclusión de plástidos y degradación del genoma) se ven comprometidos, se producen niveles sustanciales de herencia biparental (Figs. 3e y 5). En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la herencia de plástidos es un rasgo complejo que se ve afectado por factores tanto genéticos como ambientales.

Aunque la mayoría de los organismos heredan sus plastidios y/o mitocondrias por vía materna, la herencia biparental ha evolucionado múltiples veces de forma independiente tanto en animales como en plantas46. Será interesante investigar especies que exhiban herencia biparental de plastidios y/o mitocondrias, y determinar los patrones de expresión de genes para proteínas citoesqueléticas (especialmente aquellas que han sido implicadas en el movimiento de orgánulos47,48,49) y la actividad de las proteínas dirigidas a orgánulos. nucleasas durante la gametogénesis masculina. Los homólogos de DPD1 están presentes tanto en angiospermas como en gimnospermas42, y los componentes citoesqueléticos también están generalmente muy conservados. Estos genes candidatos y sus patrones de expresión también podrían explicar la variación en las tasas de herencia de plastidios biparentales en poblaciones naturales20 y los cambios en los modos de herencia observados en escalas de tiempo evolutivas2.

Dada la alta conservación del programa de gametogénesis masculina en las plantas con semillas, especulamos que los mecanismos identificados en nuestro trabajo probablemente sean relevantes para todas las especies de plantas con semillas. Sin embargo, es importante señalar que los mecanismos aquí informados operan principalmente durante el PMI. Parece posible que los factores maternos y/o los mecanismos post-fertilización también contribuyan al control de la herencia citoplasmática en las plantas.

Nuestro trabajo también proporciona métodos simples para alterar los patrones de herencia de organelos. A la luz de nuestros hallazgos, los cambios hacia la herencia biparental se pueden lograr de forma temporal (aplicando estrés escalofriante) o permanente (mediante intervenciones genéticas, por ejemplo, la edición del gen DPD1). Cambiar el modo de herencia de los orgánulos tiene importantes aplicaciones en el fitomejoramiento. En la mayoría de los cultivos, tanto los plastidios como las mitocondrias se heredan por vía materna, lo que hace muy difícil separar la influencia del plastidio de la del genoma mitocondrial en rasgos fenotípicos importantes como el crecimiento, el rendimiento y la tolerancia al estrés23,43,50,51. La inducción de la transmisión biparental permitirá la separación de los plastidios de los efectos mitocondriales aprovechando la segregación aleatoria y la clasificación de los dos tipos de orgánulos en la progenie.

Finalmente, nuestro hallazgo de que el estrés por frío leve desencadena tasas sustanciales de herencia de plástidos biparentales tiene consecuencias de gran alcance para nuestra comprensión de la evolución del genoma organelar. Las bajas temperaturas (10 °C) son omnipresentes en la naturaleza, por lo que nuestros hallazgos brindan la posibilidad de que los orgánulos participen con frecuencia en la reproducción sexual. Suponiendo que nuestros hallazgos aquí reportados se extiendan a la herencia mitocondrial, las mitocondrias transmitidas por vía paterna podrían fusionarse con sus contrapartes maternas, lo que llevaría a la recombinación del genoma52,53. Esto podría contrarrestar eficazmente el trinquete de Muller generando nuevas variaciones en los genomas mitocondriales y facilitando la combinación de mutaciones favorables.

A diferencia de las mitocondrias de las plantas, la fusión y la recombinación del genoma en los plastidios parecen ser raras17,18,19. Sin embargo, la herencia biparental inducida por la temperatura también proporciona un mecanismo para que los plastidios se propaguen a través del polen entre especies y poblaciones, un fenómeno conocido como captura de cloroplastos22,54. Curiosamente, la evidencia acumulada sugiere que el genoma de los plástidos desempeña un papel en la tolerancia a las bajas temperaturas55,56, proporcionando así potencialmente un vínculo directo entre la herencia, la selección y la adaptación de los plástidos biparentales inducida por el frío.

En resumen, los datos presentados aquí demuestran que la herencia de los plástidos está controlada en dos pasos distintos en la gametogénesis masculina y determinada por la interacción sinérgica entre el gen y el medio ambiente. Nuestro hallazgo de que la herencia uniparental de los plastidios se rompe en condiciones de estrés ambiental leve indica que los genomas de los orgánulos experimentan episodios de herencia biparental y arroja dudas considerables sobre el principio de larga data de que los orgánulos son sistemas genéticos asexuales.

Se cultivaron plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana) en condiciones estándar de invernadero a una intensidad de luz de ~300 μE m-2 s-1 en un régimen de 16 h de luz/8 h de oscuridad (temperatura diurna: ~25 °C, temperatura nocturna: ~20°C). Las líneas transplastómicas (con un fondo nuclear de tipo salvaje; WTptGFP) utilizadas como donantes de polen albergan un casete de expresión de gfp y el marcador seleccionable aadA que codifica una enzima que confiere resistencia a espectinomicina31. Las líneas transplastómicas (WTptDsRed) utilizadas para estudios de microscopía confocal albergan un casete de expresión de DsRed (impulsado por el promotor del operón de ARN ribosómico y una región quimérica 5' no traducida de los genes psbA y clpP del cloroplasto) y el marcador de resistencia a espectinomicina aadA57. La germinación de semillas y el cultivo de plantas in vitro se realizaron en medio sintético solidificado con agar que contenía 3% (p/v) de sacarosa58. Los tratamientos de estrés abiótico se realizaron en cámaras de ambiente controlado.

Las plantas transplastómicas homoplasmáticas se cultivaron en condiciones estándar de invernadero y se transfirieron a la condición de estrés abiótico designada en cámaras de ambiente controlado al inicio del desarrollo de las flores (Fig. 1a). Para garantizar que el desarrollo del gametofito masculino se produjera bajo estrés, se eliminaron los botones florales de ≥10 mm de longitud durante la transferencia (Datos ampliados, Fig. 1). Se aplicó un alto estrés lumínico cambiando las plantas a una intensidad de luz de 1000 μE m-2 s-1. Se aplicó estrés por sequía reteniendo agua hasta que se produjo una pérdida visible de turgencia y marchitez. El estrés por calor se aplicó cambiando las plantas a 35 °C, y el estrés por frío se realizó cambiando las plantas a 10 °C. Tras la maduración del polen, se realizaron cruces a gran escala mediante polinización manual31, utilizando polen de plantas transplastómicas (WTptGFP o T1 dpd1ptGFP) cultivadas en condiciones estándar de invernadero o bajo estrés abiótico. Se utilizaron plantas cultivadas en invernadero con plastidios de tipo salvaje como receptores maternos: plantas Nt-nms androestériles en el Experimento 131 y plantas castradas de tipo salvaje en los Experimentos 2 y 3.

Se analizó la transmisión de plastidios paternos en la progenie resultante mediante la germinación de semillas en medio sintético en presencia de espectinomicina (500 µg ml-1), a una densidad de aproximadamente 500 plántulas por placa de Petri de 180 mm de diámetro o placa cuadrada de 120 mm. Los fenotipos de las plántulas se analizaron mediante detección visual bajo un estereomicroscopio (Zeiss), seguido de una inspección de los sectores verdes detectados (resistentes a los antibióticos) mediante microscopía UV y confocal para probar la fluorescencia de GFP. Las líneas de herencia de plastidios paternos (PPI) se transfirieron al suelo, se cultivaron hasta la madurez en el invernadero y se autofecundaron para la producción de semillas. Se analizó la herencia estable de los plástidos paternos en las semillas mediante germinación en medio sintético solidificado con agar con espectinomicina (500 µg ml-1).

Para regenerar plantas que contienen plastidios paternos, se extirparon sectores verdes (resistentes a espectinomicina) de los cotiledones u hojas primarias y se regeneraron en un medio de regeneración de plantas solidificado con agar58 que contenía 3% (p/v) de sacarosa, 0,1 mg ml-1 de ácido 1-naftalenacético. (NAA), 1,0 mg ml-1 de 6-bencilaminopurina (BAP) y 500 µg ml-1 de espectinomicina. Para eliminar los mutantes espontáneos resistentes a la espectinomicina, las muestras de tejido se expusieron a una doble selección en un medio que contenía espectinomicina y estreptomicina (500 µg ml-1 cada una). Las células espontáneas resistentes a la espectinomicina se blanquean en este medio, mientras que las células con plastidios transgénicos que expresan aadA permanecen verdes y continúan creciendo59,60. Para obtener semillas, se enraizaron líneas homoplásmicas regeneradas con plastidios paternos y se propagaron en medio sintético en presencia de espectinomicina (500 µg ml-1).

Se identificaron sectores verdes que potencialmente albergaban plastidios paternos en plántulas en germinación mediante inspección visual y/o microscopía óptica utilizando un estereomicroscopio (Stemmi 2000-C; Zeiss). La fluorescencia de GFP se detectó con un estereomicroscopio de fluorescencia MZ FLIII (Leica) utilizando filtros GFP2 (filtro de excitación: BP 480/40 nm, filtro de barrera: LP 510 nm) y GFP3 (filtro de excitación: BP 470/40 nm, filtro de barrera: BP 525 /50 nm). La localización subcelular de la fluorescencia de GFP se determinó mediante microscopía UV con un Axioskop 2 (Zeiss; filtro de excitación: BP 450/90 nm, filtro de barrera: BP 515/65 nm), o mediante microscopía confocal de escaneo láser (TCS SP8; Leica) usando un láser de argón para excitación (a 488 nm), un filtro de 500 a 510 nm para la detección de fluorescencia de GFP y un filtro de 610 a 700 nm para la detección de fluorescencia de clorofila. La localización subcelular de la fluorescencia de DsRed se determinó mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica) utilizando un láser de estado sólido bombeado por diodos para la excitación (a 561 nm) y un filtro de 575 a 605 nm para la detección de la fluorescencia de DsRed.

Para visualizar el CCW transitorio, se extrajeron granos de EBP de botones florales con un tamaño de 15 a 18 mm (plantas cultivadas a 20 a 25 °C) o de 32 a 35 mm (plantas cultivadas a 10 °C). El CCW se tiñó con una solución de azul de anilina decolorada (azul de anilina al 0,1% (p/v) (Sigma) en K3PO4 0,1 M (pH 11,0)) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se tomaron imágenes de las muestras teñidas mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica) utilizando un láser de argón para la excitación a 405 nm y un filtro de 494 a 544 nm para la detección de la emisión de fluorescencia. Las imágenes de pila Z se realizaron con un Leica TCS SP8 utilizando el sistema de flujo Galvo y configuraciones optimizadas con un tamaño de paso de ~0,34 µm.

Para visualizar el ADN nuclear de la célula generativa dentro de los tubos polínicos, se separaron de dos a tres anteras de las flores en la antesis y se recogieron en un tubo Eppendorf de 2 ml. Los granos de polen maduros se liberaron del estambre mediante agitación. Posteriormente, se descartaron los estambres y se agregaron 100 µl de tampón de germinación de polen (ácido bórico 1,6 mM, nitrato de calcio 3,0 mM, nitrato de potasio 1,0 mM, sulfato de magnesio 0,8 mM, sacarosa al 10 %, pH 7,4) suplementados con tinción SYTO11 1 µM (Thermo Fisher). fueron añadidos al polen. La incubación se realizó en oscuridad a temperatura ambiente durante 120-180 min. Se tomaron imágenes de los tubos polínicos teñidos mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica) utilizando un láser de argón de 488 nm para la excitación y un filtro de 500 a 550 nm para la detección de la señal SYTO11.

Para determinar el efecto de la temperatura sobre la viabilidad del polen, se separaron las anteras de las flores en la antesis y se recogieron en un tubo Eppendorf de 5 ml. Los granos de polen se recolectaron mediante agitación con tampón de recolección de polen (Na3PO4 100 mM (pH 7,0) y Na2EDTA 1 mM (pH 8,0)), seguido de centrifugación a 1000 x g durante 5 minutos. Luego, el sedimento de polen se resuspendió y se tiñó en una solución de viabilidad de polen (Na3PO4 100 mM (pH 7,0), Na2EDTA 1 mM (pH 8,0), yoduro de propidio 10 μM (Abcam) y 20 μg ml-1 de diacetato de fluoresceína Sigma) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se tomaron imágenes de las muestras teñidas mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica). El diacetato de fluoresceína se excitó con un láser de argón de 488 nm y la señal de emisión se recogió a 500–550 nm. El yoduro de propidio se excitó con un láser de argón de 561 nm y su señal de emisión se recopiló a 600-650 nm.

Para visualizar el ADN nuclear y orgánulo, se extrajeron microsporas uninucleadas (UNM) y granos de polen maduros (MPG) de botones florales con tamaños de aproximadamente 10 mm (para UNM) o de flores en antesis (para MPG). El ADN se tiñó con una solución de tinción de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Na3PO4 100 mM (pH 7,0), Triton X-100 al 0,1 % (v/v), Na2EDTA 1 mM (pH 8,0) y 1 μg ml-1. −1 DAPI) a temperatura ambiente durante 30 min. Se tomaron imágenes de las muestras teñidas mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica) utilizando un diodo láser de 405 nm para la excitación y un filtro de 430 a 495 nm para la detección de la emisión de fluorescencia. Para el método de calabaza con polen, se colocaron granos de polen teñidos en un portaobjetos de vidrio y se aplastaron suavemente dando golpecitos en el cubreobjetos41. Se obtuvieron imágenes del polen aplastado mediante microscopía confocal (Leica TCS SP8), con imágenes de pila en z utilizando el sistema de flujo Galvo y configuraciones optimizadas con un tamaño de paso de ~0,30 µm.

La secuencia de proteínas de DPD1 de Arabidopsis thaliana (AT5G26940) se utilizó como consulta en una búsqueda de estructuras genómicas en el borrador disponible del genoma de N. tabacum61. Se identificaron dos homólogos y se denominaron NtDPD1S y NtDPD1T (andamios Nitab4.5_0002715 y Nitab4.5_0014337, respectivamente). Las estructuras de transcripción de ambos loci se dedujeron de las secuencias presentes en el transcriptoma asociado (Nitab4.5_0002715g0070.1 y Nitab4.5_0014337g0020.1). Ambas secuencias genómicas de NtDPD1 se dividieron en fragmentos de 2 kb y se usaron como entrada para la generación de sgRNA usando CRISPOR62. Se eligió un par de sgRNA para la edición del gen NtDPD1 (sgRNA L1: 5′-GTCCAGACATTAGTCAATCC...-3′; sgRNA R1: 5′- GATGCCCCTTCAATAAGAGAA...-3′, con los nucleótidos 2–20 correspondientes a la secuencia objetivo) . Las secuencias diana están completamente conservadas en ambos loci NtDPD1.

Se ensambló el plásmido pEG001 para la expresión constitutiva de cas9 en células vegetales. pEG001 es un derivado del plásmido pJF1031 descrito anteriormente63. La columna vertebral de pJF1031 se escindió mediante digestión con las enzimas de restricción SpeI y XbaI y purificación del fragmento de ~14,5 kb obtenido, lo que dio como resultado la eliminación del promotor que impulsa cas9. El promotor de ~1,5 kb del gen HPL de A. thaliana (hidroxiperóxido liasa, AT4G15440) se amplificó a partir del plásmido pORE E264 utilizando los cebadores oEG126 y oEG127 (Tabla de datos ampliados 4) y se integró en la columna vertebral de pJF1031 mediante una reacción de ensamblaje de Gibson65 ( New England Biolabs), dando como resultado el plásmido pEG001. Para la edición de genes en los loci NtDPD1, se construyó el vector pEG037. Se usaron los cebadores oEG315 y oEG320 (Tabla de datos ampliados 4) para amplificar un fragmento del plásmido pJF104663 que contiene parte de un andamio de sgRNA, el promotor U6 y el terminador U6. Los cebadores introducen las secuencias de direccionamiento de sgRNA L o R, respectivamente, así como sitios BsaI en ambos extremos del fragmento. El producto de la PCR se clonó en pEG001 mediante una reacción simultánea de restricción y ligadura de BsaI66. El vector binario resultante pEG037 para la mutagénesis de NtDPD1 contiene un marcador de resistencia a higromicina para la selección en planta y un marcador de kanamicina para la selección en bacterias. Las secuencias de todos los oligonucleótidos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de datos ampliados 4.

Se supertransformaron plantas transplastómicas con un fondo nuclear de tipo salvaje (WTptGFP) con la cepa GV2260 de Agrobacterium tumefaciens que alberga el vector pEG037 utilizando el método de infiltración de disco foliar. Las líneas de plantas seleccionadas resistentes a la higromicina se mantuvieron en medio que contenía higromicina (15 mg l-1) y cefotaxima (250 mg l-1) para la selección continua de células vegetales transgénicas y la eliminación de células residuales de Agrobacterium, respectivamente. Datos ampliados La Fig. 3 ilustra el genotipado basado en PCR (Reacciones 1 a 3) de líneas transgénicas y el procedimiento de detección que condujo al aislamiento del doble mutante dpd1 (tetraalélico). Debido a la alotetraploidía del genoma de N. tabacum, el proceso de selección se diseñó para identificar plantas con cuatro homeoalelos DPD1 knockout en estado diploide (es decir, dos alelos S y dos T; Fig. 4a). Se emplearon PCR y secuenciación para identificar plantas con actividad somática de Cas9 y mutaciones knockout deseables en dpd1 (Datos ampliados, figura 4). Los pasos de regeneración adicionales en el cultivo de tejidos ayudaron a purificar los eventos de mutación deseados y a reducir la complejidad del alelo que surge de la expresión constitutiva de Cas9.

Los polimorfismos entre los loci S y T permitieron la clasificación de las secuencias amplificadas como homeoalelos S o T después de la secuenciación (Fig. 3a, by Datos ampliados Fig. 4). La reacción 1 (Datos ampliados, Fig. 4b) genera un producto corto solo cuando se generó una eliminación grande entre los sitios objetivo L y R. La presencia de este producto implica que la línea de la planta posee un Cas9 activo, y al menos un alelo mutante puede ser con confianza. identificado por esta PCR. Los cebadores utilizados en la Reacción 2 (Datos ampliados, Fig. 4b) flanquean el sitio objetivo del sgRNA L. Esta reacción se realizó para identificar los otros tres alelos mutantes mediante secuenciación directa de Sanger de productos de PCR amplificados de ~ 320 muestras T0 analizadas. La aparición de pequeños InDel a menudo causaba que la Reacción 2 produjera electroferogramas que mostraban varios perfiles de picos superpuestos. Siempre que se obtuvieron perfiles de hasta tres secuencias superpuestas, se intentó la deconvolución de las cadenas de secuencia mediante inspección visual. En el sitio L, Cas9 frecuentemente causaba pequeños InDels (de -4 a +1 pb) y producía patrones de picos desplazados reconocibles en comparación con las secuencias conocidas de tipo salvaje S y T, que podían desconvolucionarse incluso cuando tres secuencias se superponían. Después de tres rondas de detección por PCR y dos rondas de regeneración en cultivo de tejidos, se aisló una línea vegetal mutante doble dpd1 (para simplificar, denominada dpd1). La secuenciación de Sanger confirmó que dpd1 posee cuatro alelos mutantes distintos en el sitio L (Fig. 3a, by Datos ampliados, Fig. 4). Una de las secuencias era una eliminación grande y las otras tres secuencias eran mutaciones por cambio de marco.

La planta T0 dpd1 se transfirió al invernadero donde se obtuvieron semillas T1 por autofecundación. La presencia de mutaciones en el sitio L se confirmó genotipando las plántulas T1 (realizando las Reacciones 1 y 2; Datos ampliados, Fig. 4b). La segregación de alelos en la generación T1 facilitó la secuenciación individual de los cuatro alelos después de la PCR y la purificación en gel, ya que la Reacción 2 produce productos de diferente tamaño para los loci S y T. Las mutaciones en el sitio sgRNA R se analizaron en plántulas T1 mediante la Reacción 3 (Datos extendidos, Fig. 4b), aplicando deconvolución visual cuando fue necesario. El vínculo entre las mutaciones en los sitios objetivo L y R se estableció mediante la observación de la cosegregación de alelos genotipados en la generación T1 (se analizaron 23 plántulas). No se identificaron otros alelos en la línea final dpd1, lo que sugiere que los cuatro alelos mutantes detectados en la generación T0 se habían fijado.

Para el análisis de transferencia en gel de ADN, se aisló el ADN total de la planta utilizando un protocolo basado en bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)67. Las muestras de ADN extraídas se digirieron con las enzimas de restricción XhoI y EcoRV, se separaron mediante electroforesis en gel en geles de agarosa al 0,8% y se transfirieron a membranas de nailon Hybond N (GE Healthcare) utilizando protocolos estándar. Para la hibridación, se generaron sondas marcadas con α[32P]dCTP mediante cebado aleatorio (kit de etiquetado de ADN Multiprime, GE Healthcare). Se utilizó como sonda para el análisis RFLP un producto de PCR que cubre parte del gen 16S rRNA (amplificado por los cebadores P16Srrn-F y P16Srrn-R, y purificado mediante electroforesis en gel de agarosa). Las hibridaciones se llevaron a cabo a 65–68 °C en tampón de hibridación rápida (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para las reacciones de genotipado, se extrajo ADN genómico del tejido de la hoja con el kit Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich). Se usó un µl como plantilla para la PCR. Para la clonación y para la detección inicial basada en PCR de mutaciones dpd1, se utilizó la ADN polimerasa Phusion (Thermo Fisher). En todas las demás reacciones de PCR, se utilizó ADN polimerasa DreamTaq (Thermo Fisher). Los productos de PCR se purificaron en columna antes de la secuenciación (NucleoSpin Gel y PCR Clean-up, Macherey-Nagel).

El ADN total (que comprende ADN nuclear y orgánulo) de fracciones de polen enriquecidas se preparó utilizando un protocolo publicado41. Los granos de polen de tabaco se recolectaron frotando anteras dehiscentes de tres flores abiertas (plantas WTptGFP y dpd1ptGFP, respectivamente) en la pared de un tubo Eppendorf de 1,5 ml, seguido de la adición de 100 µl de agua destilada para la resuspensión. Debido al procedimiento utilizado para la recolección de polen, no se puede evitar cierto nivel de contaminación por otros tipos de células de anteras, por lo que las muestras deben considerarse preparaciones de polen enriquecidas (en lugar de fracciones de polen puro). La suspensión de polen enriquecida se incubó a 95 °C durante 5 minutos, se centrifugó a 16.000 xg durante 5 minutos y luego se sometió a PCR en tiempo real para determinar las cantidades relativas de ADN nuclear y plástido. Se utilizaron 18S rDNA (gen nuclear) y aadA (transgén presente en el genoma de plastidios de WTptGFP y dpd1ptGFP) como sustitutos de la abundancia de ADN nuclear y de plastidios, respectivamente. Se utilizaron los cebadores oCK68 y oCK69 para la amplificación del ADNr 18S, y los cebadores oKPC579 y oKPC580 para la amplificación de aadA (Tabla de datos ampliados 4). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480 y las mezclas de reacción LightCycler SYBR Green (Roche). La cantidad relativa de ADN plástido en las fracciones de polen enriquecidas se determinó mediante la abundancia del amplicón aadA normalizado a la abundancia del ADNr 18S. La cuantificación relativa se realizó mediante el método ΔΔCt68.

Los efectos cuantitativos del genotipo y los tratamientos de estrés sobre la transmisión de plastidios paternos, la inclusión de plastidios en la célula generativa y la supervivencia del polen (después del estrés por frío o al comparar el mutante WTptGFP y dpd1ptGFP) se estimaron utilizando modelos lineales generalizados. Los modelos se construyeron con el método de máxima verosimilitud en R v3.5.3 (https://www.R-project.org/). El genotipo, el tratamiento y el experimento (etapa de visualización en polen; experimentos independientes para determinar la transmisión por plastidios) se propusieron a priori como variables explicativas. Se seleccionaron cinco modelos para el análisis de datos (Modelos 1 a 5).

Los conjuntos de datos para la inclusión de plástidos en la célula generativa (para el Modelo 2), la supervivencia del polen bajo estrés por frío (Modelo 4) y la supervivencia del polen en los genotipos de tipo salvaje y dpd1 (Modelo 5) se modelaron como proporciones de resultados binarios utilizando el método binomial. distribución. La cantidad total de granos de polen analizados por unidad de replicación se proporcionó en el argumento 'pesos' de glm(), como se recomienda69. Los dos conjuntos de datos de transmisión de plastidios paternos (uno que representa el Experimento 1, el otro que incluye los Experimentos 1, 2 y 3) se modelaron utilizando la distribución binomial negativa (para los Modelos 1 y 3), después de que se encontró evidencia de sobredispersión en las versiones preliminares de Poisson de estos modelos. . La unidad de replicación en los Experimentos 1, 2 y 3 es la "cosecha": un lote de semillas obtenidas de un conjunto de receptores maternos (5 a 30 plantas) fertilizadas por donantes de polen de un único tratamiento (3 a 8 plantas). Para la modelación de proporciones y tasas, se estableció como variable respuesta el conteo de plántulas con sectores por unidad de replicación, mientras que como compensación se proporcionó la cantidad total de plántulas analizadas. 'log' se utilizó como función de enlace para todos los modelos.

Para cada conjunto de datos, se generó un modelo inicial que incluye parámetros de efecto para las variables explicativas e interacciones propuestas. Todos los parámetros del efecto se modelaron en relación con niveles específicos de la variable explicativa ("contraste con el tratamiento"). Los modelos se seleccionaron según el AIC mínimo (Criterio de información de Akaike), por considerarse los más parsimoniosos70: se utilizó una versión corregida para tamaños de muestra pequeños (AICc) como se recomendó anteriormente71. Del modelo inicial y siguiente, los parámetros se eliminaron secuencialmente y solo si conducían a una reducción del AICc. La sobredispersión de los modelos preliminares de Poisson se comprobó realizando una prueba de razón de verosimilitud (LRT): este cambio resultó en una gran reducción en AICc. Los modelos finales con AICc mínimo (uno por conjunto de datos) se denominaron Modelos 1 a 5. La bondad de ajuste se probó para estos modelos utilizando LRT comparando (1) cada modelo seleccionado con un modelo "saturado", donde la prueba proporciona una medida general de si el modelo se ajusta bien a los datos, o (2) el modelo seleccionado con un modelo competidor. modelo para medir la bondad relativa de ajuste. Se confirmó que los modelos 1 a 5 se ajustaban tan bien como el modelo saturado. Las estimaciones de los parámetros en los modelos seleccionados se evaluaron con pruebas z de Wald simultáneas (de dos colas). No se aplicaron correcciones para comparaciones múltiples para las pruebas z.

Se construyeron modelos binomiales negativos utilizando la función glm.nb() del paquete MASS v7.3.5472. Los valores de los parámetros, los errores estándar y las estadísticas z de Wald con valores P se recuperaron utilizando el paquete Insight v0.2.0 (https://easystats.github.io/insight/), o directamente desde glm() y glm.nb(). salidas (Tabla de datos ampliados 2). Los parámetros, errores y CI95 (intervalos de confianza del 95%) se transformaron para que los modelos fueran log-lineales en base 10. Los AICc se obtuvieron a través del paquete MuMIn v1.43.6 (https://CRAN.R-project.org/package= MuMIN). Los Wald CI95 para estimaciones de parámetros se calcularon utilizando la función confint.default() en el paquete base. Las medias ajustadas por el modelo se obtuvieron a partir de la salida de glm(), y los CI95 para las medias estimadas se obtuvieron utilizando el paquete ciTools v0.6.1 (https://CRAN.R-project.org/package=ciTools). Los LRT para sobredispersión se calcularon usando odTest() del paquete pscl v1.5.5 (https://github.com/atahk/pscl/), y los LRT restantes se realizaron usando el paquete de estadísticas base. Se accedió a R a través de R Studio v2022.07.2 Build 576.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este trabajo están disponibles en el documento y en sus archivos de información complementaria. Las secuencias de Arabidopsis (AT5G26940.1 y AT4G15440) están disponibles a través de TAIR (https://www.arabidopsis.org/). Las secuencias genómicas de Nicotiana (andamios Nitab4.5_0002715 y Nitab4.5_0014337) y las transcripciones (Nitab4.5_0002715g0070.1 y Nitab4.5_0014337g0020.1) están disponibles en Sol Genomics Network (https://solgenomics.net/). Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código R utilizado para ensamblar los modelos estadísticos está disponible en GitHub en https://github.com/egonzalezduran/modelsplastidinheritance.

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Agradecemos a los siguientes miembros del equipo MPI-MP: C. Hasse, S. Braune, R. Martens, S. Otto, C. Schmidt, S. Grebe, J. Bartetzko, N. Wulff, G. Olar y J. Abaya por ayudar con cruces y ensayos de semillas; X. Kroop y A. Schadach por su ayuda con el cultivo de tejidos y los experimentos de hibridación; C. Krämer por proporcionar oligonucleótidos para el análisis de qPCR; F. Kragler por su ayuda y asesoramiento experto sobre microscopía confocal; y al MPI-MP GreenTeam para ayudar con el cultivo de plantas y la transformación nuclear. Esta investigación fue financiada por la Sociedad Max Planck.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Kin Pan Chung, Enrique González-Durán y Stephanie Ruf.

Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, Potsdam-Golm, Alemania

Kin Pan Chung, Enrique González-Durán, Stephanie Ruf y Ralph Bock

Universidad de Hamburgo, Instituto de Ciencias Vegetales y Microbiología, Hamburgo, Alemania

Pierre Endries

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KPC, SR y EG-D. y RB diseñó la investigación. KPC, SR y EG-D. y PE realizó los experimentos. Todos los autores contribuyeron al análisis e interpretación de los datos. RB escribió el manuscrito, con aportaciones del KPC, SR y EG-D. Todos los coautores comentaron sobre el borrador del manuscrito.

Correspondencia a Ralph Bock.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Wataru Sakamoto, Anil Day y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se aplicó estrés abiótico en las primeras etapas del desarrollo del gametofito masculino. Se eliminaron los botones florales de ≥10 mm de longitud de las plantas WTptGFP antes de transferirlas a cámaras de ambiente controlado para aplicar estrés. Las puntas de flecha blancas indican la ventana de desarrollo de los botones florales en el momento de la transferencia de la planta a la condición estresante. El desarrollo del polen en estos cogollos (<10 mm de largo) ocurre en gran medida bajo estrés. Barra de escala, 10 mm.

a, Las semillas cosechadas de experimentos de cruce se germinaron en un medio sin antibióticos. Barra de escala, 10 mm. b, Imágenes estereomicroscópicas de una plántula que contiene plastidios heredados del padre y cultivados en un medio sin antibióticos. Se muestran la imagen microscópica de campo brillante (izquierda), la imagen de fluorescencia de GFP (centro) y la imagen de fluorescencia de clorofila (derecha). Las puntas de flecha 1 y 2 apuntan a dos sectores que contienen plastidio paterno, como lo demuestra la fluorescencia de GFP. Barra de escala, 1 mm. c, Visualización de plastidios paternos por su resistencia a los antibióticos. La plántula que se muestra en b se transfirió a un medio que contiene espectinomicina que provoca el blanqueamiento de las células que contienen sólo plastidios maternos. Las fotografías se tomaron 7 días (izquierda; barra de escala, 1 mm), 20 días (centro; barra de escala, 1 mm) y 48 días (derecha; barra de escala, 10 mm) después de la transferencia. d, Frecuencia de transmisión de plastidios paternos observada en ausencia de selección de espectinomicina.

a, Flores desarrolladas en condiciones estándar de invernadero (izquierda, 20–25 °C) en comparación con flores desarrolladas bajo estrés por frío (derecha, 10 °C). b, Imágenes de microscopía de barrido láser confocal de polen binucleado temprano (EBP) recolectado de plantas WTptDsRed cultivadas a 10 °C. La pared celular callosa que separa la célula generativa de la vegetativa se tiñó con azul de anilina para visualizar el patrón de división. Además del patrón de división celular normal (izquierda, asimétrico), se observan varios defectos en la división celular (centro y derecha) en el polen desarrollado a 10 °C. Este experimento se repitió cuatro veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 10 μm. c, Imágenes de microscopía confocal de granos de polen maduros (MPG) de plantas de tabaco silvestres cultivadas en condiciones estándar de invernadero (izquierda, 20–25 °C) o bajo estrés por frío (derecha, 10 °C). Las MPG se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) para determinar la viabilidad del polen. La fluorescencia verde demuestra que el polen es viable, porque la actividad de la esterasa citoplasmática convierte el FDA en fluoresceína. El polen muerto muestra solo fluorescencia de PI dentro del grano, debido a la ausencia de fluorescencia derivada de la FDA y permeabilidad al PI. Este experimento se repitió tres veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 100 μm. d, Cuantificación de la viabilidad del polen. Las proporciones de polen viable por réplica biológica (sesión de imágenes) se modelaron utilizando la distribución binomial (Modelo 4 construido con nrep.total = 6, 3 sesiones por grupo, ~3100 granos de polen analizados; consulte las Tablas de datos ampliados 1 y 2). Los cuadros de colores sombreados muestran el intervalo de confianza del 95% (IC95) de las estimaciones medias. βchilling representa el efecto del tratamiento de enfriamiento sobre la supervivencia del polen (P = 1,64 × 10−176), expresado como log10 del cambio (Tabla de datos ampliados 2). La estimación del parámetro se probó mediante una prueba z de Wald de dos colas. ***, P < 0,001; α = 0,05.

a, Sitios de unión del cebador (oEG) en la secuencia genómica de NtDPD1. Los cuadros representan exones. TSS es el sitio de inicio de la transcripción según los datos del transcriptoma. Las áreas azul y naranja indican las secuencias codificantes de proteínas en los dos subgenomas diploides (S: Nicotiana sylvestris; T: Nicotiana tomentosiformis). El dominio exonucleasa conservado está representado por el color más oscuro. Las secuencias a las que se dirige la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 (sitios de unión de sgRNA; sgRNA L: sgRNA 'izquierdo'; sgRNA R: sgRNA 'derecho') se indican con barras verticales rojas y puntas de flecha negras. También se muestran los codones de inicio y parada. b, reacciones de PCR utilizadas para el genotipado de los loci DPD1. Las marcas rojas representan las mutaciones producidas por la escisión de Cas9 en los sitios objetivo L y R. Las deleciones grandes (ΔΔ) son el resultado de una doble escisión y la pérdida del fragmento entre los sitios L y R. c, Estructura del ADN-T en el vector de transformación pEG037 utilizado para la mutagénesis de NtDPD1. RB y LB son los límites del ADN-T. PU6 y TU6 son promotor y terminador, respectivamente, del gen U6 snRNA de Arabidopsis thaliana. Los sgRNA R y L se muestran como cuadros rojos. PHPL es el promotor del gen HPL de A. thaliana (AT4G15440). zCas9 es una versión del gen cas9 que fue optimizada con codones para Zea mays. TRbcS, terminador de subunidad pequeña de Rubisco; P35S, doble promotor CaMV 35S; hpt, gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a la higromicina en la planta. d, descripción esquemática de la generación de mutantes dpd1. Después de la transformación mediada por Agrobacterium con el vector pEG037, se realizaron genotipado basado en PCR y ciclos de regeneración adicionales en cultivo de tejidos. La expresión somática de Cas9 del promotor HPL potencialmente causa diferentes mutaciones en diferentes partes de las plantas. Las plantas con supuestos alelos knock-out de DPD1 se identificaron mediante genotipado por PCR y secuenciación de ADN, y se realizaron rondas de regeneración adicionales para reducir el mosaicismo en las líneas mutantes mediante la obtención de regenerantes clonales a partir de células individuales. El procedimiento condujo al aislamiento de líneas vegetales en las que todas las células contienen el mismo conjunto de alelos DPD1 mutados (mutante dpd1).

Se cultivaron plantas a, WTptGFP y dpd1ptGFP en el invernadero. Se tomaron fotografías de plantas de 6 semanas, plantas de 9 semanas y flores completamente abiertas. b, Imágenes de microscopía confocal de granos de polen de plantas WTptGFP y dpd1ptGFP cultivadas en condiciones estándar de invernadero. Los granos de polen se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) para determinar la viabilidad del polen. Este experimento se repitió tres veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 100 μm. c, Cuantificación de la viabilidad del polen. Las proporciones de polen viable por réplica biológica (sesión de imágenes) se modelaron utilizando la distribución binomial (Modelo 5; construido con nrep.total = 6; 2228 granos de polen analizados; consulte las Tablas de datos ampliados 1 y 2). Cada réplica consistió en una única cosecha de polen de 2 a 3 flores de una sola planta, que se tiñeron y se tomaron imágenes en la misma sesión (delimitada por líneas discontinuas). Durante el análisis de los datos, se encontró que hubo una variación significativa entre las réplicas (representada por los parámetros de las réplicas con P <0,05 en la Tabla 2 de datos ampliados). Para representar mejor esta variación, el gráfico muestra las proporciones de polen viable en los 5 a 9 campos de imagen (círculos de colores) fotografiados en cada réplica. Las estimaciones medias por genotipo se indican con una barra horizontal negra. βdpd1 representa el efecto del genotipo dpd1 en la supervivencia del polen (P = 3,00 × 10−9) en comparación con el tipo salvaje en condiciones de temperatura normales (20–25 °C), expresado como log10 del cambio (Tabla de datos ampliados 2) . La estimación del parámetro se probó mediante una prueba z de Wald de dos colas. ***, P < 0,001; α = 0,05. d, Imágenes confocales de polen maduro WTptGFP y dpd1ptGFP teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas después de aplicar el método de calabaza con polen para liberar el polen maduro de las anteras. Se muestran imágenes superpuestas de pila Z con proyección maximizada (el ancho total de los cortes z de WTptGFP y dpd1ptGFP es 2,15 μm y 1,78 μm, respectivamente). Las puntas de flecha indican el núcleo vegetativo (VN) y el núcleo generativo (GN). Las flechas indican el ADN orgánulo liberado a partir del polen maduro aplastado de dpd1ptGFP. Este experimento se repitió dos veces y se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 10 μm.

Imágenes tridimensionales confocales de escaneo láser del polen binucleado temprano que se desarrolla en condiciones estándar de invernadero. Se recogió polen binucleado temprano de plantas WTptDsRed transplastómicas cultivadas en condiciones estándar, seguido de tinción con azul de anilina. La pared celular de callosa (gris) que separa la célula vegetativa y la célula generativa recién formada se visualizó mediante imágenes confocales de pila z con configuraciones optimizadas y un tamaño de paso de ~0,34 µm (ancho de los cortes: 8,5 µm). No se observan plastidios (magenta) dentro de la célula generativa, lo que coincide con la exclusión eficiente de los plastidios paternos de la célula generativa durante la gametogénesis masculina. Este experimento se repitió cuatro veces y se muestra un vídeo representativo.

Imágenes confocales tridimensionales de polen binucleado temprano que se desarrolla bajo estrés por frío. Se recogió polen binucleado temprano de plantas transplastómicas WTptDsRed cultivadas bajo estrés por frío (10 °C), seguido de tinción con azul de anilina. La pared celular de callosa (gris) que separa la célula vegetativa y la célula generativa recién formada se visualizó mediante imágenes confocales de pila z con configuraciones optimizadas y un tamaño de paso de ~0,34 µm (ancho de los cortes: 11 µm). Se observa un plastidio paterno (magenta) dentro de la célula generativa, lo que indica que el mecanismo de exclusión de plastidios durante la gametogénesis masculina se ve comprometido a baja temperatura. Este experimento se repitió cuatro veces y se muestra un vídeo representativo.

Imágenes confocales de lapso de tiempo del desarrollo temprano del tubo polínico durante la germinación in vitro bajo estrés por frío. Se recolectaron granos de polen maduros de plantas WTptDsRed transplastómicas cultivadas bajo estrés por frío (10 °C), seguido de germinación de polen in vitro y tinción con SYTO11, un tinte que se une a ácidos nucleicos. El núcleo de la célula generativa (GCN) dentro del tubo polínico en crecimiento se visualiza mediante fluorescencia verde SYTO11. Los plastidios paternos (punta de flecha, magenta) están estrechamente asociados con el GCN y rodeados por la membrana celular generativa. En consecuencia, estos plastidios muestran una dinámica de movimiento similar a la del GCN. Por el contrario, los plastidios fuera de la célula generativa (asterisco) muestran un movimiento mucho más rápido debido al intenso flujo citoplasmático en el tubo en crecimiento. Este experimento se repitió diez veces y se muestra un vídeo representativo.

Gel de agarosa sin procesar y transferencia Southern para el ensamblaje de la Fig. 1e. Izquierda: gel de agarosa con marcadores. Derecha: muestras del gel transferidas a la transferencia.

Valores de Ct y cálculos para la cuantificación relativa del ADN de plástidos.

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Chung, KP, González-Durán, E., Ruf, S. et al. Control de la herencia de plástidos por factores ambientales y genéticos. Nat. Plantas 9, 68–80 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01323-7

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Recibido: 21 de julio de 2022

Aceptado: 26 de noviembre de 2022

Publicado: 16 de enero de 2023

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01323-7

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