Perfil circadiano no destructivo del contenido de almidón en hojas frescas intactas de Arabidopsis con dos

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16525 (2022) Citar este artículo

1043 Accesos

Detalles de métricas

Los cloroplastos de las plantas realizan la fotosíntesis para convertir la energía solar en azúcares para obtener la fuente de carbono esencial para la vida y el crecimiento de las células durante el día. Una fracción de los productos fotosintéticos se almacena en los cloroplastos formando gránulos de almidón para continuar proporcionando energía de carbono durante la noche. Actualmente, perfilar el patrón temporal del almidón requiere: (i) sacrificar las hojas, o (ii) generar plantas transgénicas con el riesgo de cambiar el metabolismo mediante la incorporación de una almidón sintasa unida a gránulos (GBSS) genéticamente modificada. En este artículo, demostramos un método no destructivo que utiliza imágenes de fluorescencia de dos fotones (TPF) y generación de segundo armónico (SHG) para cuantificar los gránulos de almidón dentro de los cloroplastos de hojas frescas intactas durante un ciclo de día y noche. Lo hicimos utilizando dos líneas de Arabidopsis que tenían contenidos de almidón normales y en exceso: tipo salvaje (Columbia-0) y exceso de almidón 1 (sexo1). Los gránulos de almidón se visualizaron mediante imágenes SHG, mientras que los cloroplastos en las células del mesófilo se visualizaron mediante imágenes TPF. Nuestros resultados proporcionaron una resolución espacial a escala micrométrica de la distribución del almidón dentro de las hojas y mostraron patrones circadianos del almidón consistentes con los perfilados por ensayos enzimáticos en estudios previos. Demostramos que las imágenes TPF-SHG son una herramienta potencial para revelar la heterogeneidad en tiempo real del ritmo circadiano del almidón en las células de las hojas, sin la necesidad de una preparación destructiva de la muestra.

El almidón es el principal almacenamiento de carbohidratos en las plantas superiores1. Hay dos lugares principales donde se produce el almidón en las plantas. Uno es en las hojas donde se produce la fotosíntesis. El otro está en los órganos de almacenamiento como los tallos y las raíces. El almidón en los órganos de almacenamiento se acumula continuamente y no se degrada hasta que es necesario para el crecimiento. El almidón de las hojas, sin embargo, tiene una variación diurna. Durante el día, la fotosíntesis produce almidón que se acumula en el cloroplasto y luego forma gránulos de almidón2,3. Cuando la fotosíntesis cesa durante la noche, la energía necesaria para la supervivencia y el crecimiento celular proviene de la degradación del almidón almacenado en las hojas durante el día4,5,6. La capacidad de monitorear las variaciones inmediatas del almidón es importante para rastrear los mecanismos diarios involucrados en el metabolismo del almidón.

Los métodos comúnmente utilizados para la cuantificación del almidón incluyen métodos enzimáticos7,8, tinción de almidón y yodo y modificación genética. Los métodos enzimáticos extraen y degradan el almidón con enzimas y pueden usarse para cuantificar la cantidad total de residuos de glucosa almacenados en el almidón9. El método de tinción con solución de yodo utiliza yodo para teñir el almidón sin extraerlo de la hoja. Pero para observar claramente el almidón teñido, es necesario disolver los azúcares y la clorofila y eliminarlos con alcohol. Este método permite determinar la posición y distribución del almidón en el tejido, pero debido a la necesidad de disolver la clorofila y teñir con una solución de yodo, el método destruye las hojas durante el proceso de preparación. Otro método para la determinación del almidón es clonar una construcción que contiene un gen diana de interés y luego obtener las plantas transgénicas que portan la construcción integrada aleatoriamente en el genoma. El uso de una enzima que participa en el metabolismo del almidón y su fusión con una proteína fluorescente da como resultado una planta transgénica que permite la observación del almidón a través de imágenes fluorescentes10,11. Aunque la utilización de imágenes de proteínas fluorescentes para el análisis cuantitativo del almidón no destruye la hoja transgénica, la creación de una planta transgénica es complicada y requiere mucho tiempo, y debe realizarse para cada ecotipo de interés. Otro método no destructivo que se ha utilizado para cuantificar el almidón en plantas es la obtención de imágenes por microCT, que se aplicó específicamente al rayo y al parénquima axial (RAP) en tallos leñosos12. Debido a que este último método no proporciona un contraste único con respecto al almidón, se basa en el uso de las formas y tamaños de las células RAP del análisis de imágenes y, en general, no se puede aplicar fácilmente para la determinación del almidón.

Dado que los gránulos de almidón son semicristalinos13,14,15, un posible método para su identificación es mediante generación de segundo armónico (SHG)16,17. SHG es un proceso óptico no lineal que está permitido sólo en estructuras no centrosimétricas y se ha utilizado como mecanismo de contraste en microscopía multifotónica para obtener imágenes de una variedad de tejidos biológicos intactos, como huesos, tendones y cartílagos18,19,20. También se ha demostrado que proporciona contraste para obtener imágenes de almidón y celulosa en plantas 21–23. Para los estudios de almidón de SHG, los grupos de investigación han analizado principalmente la estructura del almidón mediante la detección de SHG después de que se extrajo el almidón24,25,26. Las imágenes SHG adquiridas generalmente se basaban únicamente en el uso de filtros espectrales para separar las señales SHG de la fluorescencia. Sin confirmación espectral, las señales de fluorescencia de ancho de banda amplio cercanas a la banda espectral SHG pueden filtrarse a través del filtro SHG y detectarse como intensidad SHG, lo que da como resultado una imagen SHG tergiversada. En este estudio, utilizamos imágenes SHG para perfilar el contenido de almidón de hojas intactas de Arabidopsis durante un ciclo de luz y oscuridad de 24 h. Las imágenes de SHG en células de hojas se colocaron subcelularmente con señales de TPF emitidas por cloroplastos, lo que sugiere que las imágenes de SHG fueron generadas por gránulos de almidón. Desarrollamos un método basado en imágenes de intensidad de SHG y TPF para cuantificar el contenido de almidón dentro del cloroplasto. Además, el mapeo espectral de la muestra confirmó aún más que las imágenes de SHG representaban fielmente las variaciones de intensidad de SHG. Demostramos la efectividad de nuestro método para monitorear las variaciones de almidón de manera no destructiva utilizando dos tipos de Arabidopsis: una Columbia-0 (Col-0) de tipo salvaje con producción normal de almidón y un mutante sex1 con un SEX1 defectuoso que previene la degradación y utilización del almidón. resultando en un exceso de acumulación de almidón en el cloroplasto. Observamos que la señal de imágenes SHG aumentó durante el día y disminuyó durante la noche siguiente en las hojas Col-0, pero se mantuvo consistentemente alta en las hojas del sexo 1. Las diferentes variaciones de SHG en ciclos dietéticos entre Col-0 y sex1 demostraron que la fluctuación de los gránulos de almidón en las células vivas se puede detectar eficazmente con imágenes de SHG.

La Figura 1 muestra las imágenes TPF y SHG de hojas frescas intactas de Col-0 y sex1. A partir de las imágenes TPF, el contraste de la autofluorescencia de la clorofila permite la visualización de los cloroplastos en las células del mesófilo. Se puede observar que la autofluorescencia no llena completamente los cloroplastos y hay muchos sitios oscuros. La columna del medio muestra las imágenes de SHG de la misma área de escaneo, donde se espera que la señal de SHG provenga de los gránulos de almidón. En la tercera columna, las imágenes fusionadas de TPF y SHG muestran que el SHG aparece dentro de los cloroplastos, en las áreas donde la señal de autofluorescencia es débil. Esto es de esperarse ya que los gránulos de almidón ocupan espacios en el estroma, mientras que la clorofila está restringida en las membranas tilacoides, lo que resulta en la separación espacial de las señales de TPF y SHG. Además, encontramos que las señales de SHG en la hoja sex1 son más fuertes que las de la hoja Col-0, lo que coincide con el exceso de almidón que se sabe está presente en el mutante sex1.

Imágenes de fluorescencia de dos fotones (TPF) y de segunda generación armónica (SHG) de una hoja fresca intacta de tipo salvaje Columbia-0 (Col-0) y de una hoja mutante fresca intacta con exceso de almidón 1 (sexo 1). La última columna muestra las imágenes combinadas de TPF y SHG. Las imágenes TPF se adquirieron con un filtro de 670/30 nm, mientras que las imágenes SHG se adquirieron con un filtro de 532/3 nm. El tiempo de permanencia de los píxeles fue de 0,016 ms y 0,128 ms para las adquisiciones de imágenes TPF y SHG, respectivamente.

Para confirmar que las imágenes de PMT adquiridas con los filtros de paso de banda SHG y TPF corresponden a la distribución espacial de almidón SHG y clorofila TPF, adquirimos un mapeo espectral en una región seleccionada del mapeo de PMT. Primero obtuvimos la imagen combinada TPF y SHG PMT de una hoja fresca intacta de Col-0 en la configuración NDD (Fig. 2a). Luego cambiamos a la detección desescaneada y adquirimos un mapeo espectral del área del cuadrado amarillo que se muestra en la Fig. 2a, con un tiempo de integración espectral de 5 s. Para cada espectro en el mapeo espectral, sumamos las intensidades espectrales en las bandas de longitud de onda correspondientes a los filtros SHG y TPF utilizados para el mapeo PMT. La Figura 2b muestra la imagen resultante con las intensidades sumadas sobre las bandas de longitud de onda de los filtros SHG y TPF representadas en verde y rojo respectivamente. La imagen corresponde al área del cuadrado amarillo en la Fig. 2a, adquirida en la configuración confocal desescaneada. La Figura 2c muestra algunos espectros seleccionados correspondientes a las posiciones marcadas en la Fig. 2b. A partir de estos espectros, vemos que en un píxel de imagen típico, están presentes tanto la característica del pico espectral SHG a 532 nm como un gran aumento espectral debido a la autofluorescencia de la clorofila. Además de la fluorescencia de la clorofila y el SHG del almidón, vemos una pequeña característica de fluorescencia adicional no identificada alrededor de 590 nm. Aunque esta característica de fluorescencia es pequeña en comparación con la fluorescencia de la clorofila, su cola de fluorescencia puede hacer una pequeña contribución a la banda SHG de 532 nm en la imagen PMT. La Figura 3 muestra imágenes y mapeo espectral similares para una hoja fresca de sexo1, pero con un tiempo de integración espectral más corto de 0,3 s. Debido a la mayor cantidad de almidón presente en el mutante sex1, el tiempo de integración más corto puede producir espectros con intensidades de SHG comparables a las del tipo salvaje Col-0. Estas observaciones espectrales proporcionan confirmación de que las imágenes PMT filtradas por SHG corresponden a la intensidad de SHG, lo que nos permite utilizar la intensidad de SHG para cuantificar la cantidad de almidón presente en la hoja. Las mayores intensidades de SHG observadas en sex1 son consistentes con el hecho de que los mutantes sex1 conducen a una mayor acumulación de almidón en el cloroplasto que los tipos salvajes Col-0.

Mapeo espectral de una hoja fresca de Col-0. (a) Imágenes de TPF (rojo) y SHG (verde) de una hoja fresca intacta de Col-0 de tipo salvaje. (b) Mapeo espectral del área del cuadro amarillo en (a), con la intensidad espectral total de la banda de 655 a 685 nm mostrada en rojo y la banda de 530,5 a 533,5 nm en verde. (c) Espectros seleccionados del mapeo espectral con integración de 5 s, con la característica del pico SHG visible.

Mapeo espectral de una hoja mutante sex1 intacta y fresca. una imagen TPF (rojo) y SHG (verde) de una hoja mutante sex1 intacta y fresca. b Mapeo del espectro del área del recuadro amarillo en (a), con la intensidad espectral total de la banda de 655 a 685 nm mostrada en rojo y la banda de 530,5 a 533,5 nm en verde. (c) Espectro de puntos seleccionados mostrados en (b) con integración de 0,3 s. El espectro del punto 1 muestra una característica de pico SHG con una fluorescencia de clorofila más baja.

Como prueba de la aplicabilidad de nuestro sistema para monitorear el contenido de almidón en hojas frescas intactas, diseñamos un experimento para monitorear la variación diurna de los gránulos de almidón. Se sabe que los gránulos de almidón de las hojas se sintetizan mediante la fotosíntesis durante el día y se degradan durante la noche para proporcionar energía a la planta durante las horas de oscuridad. La Figura 4 muestra la secuencia de imágenes TPF y SHG en hojas Col-0 o sex1 en un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Los valores de intensidad corresponden al recuento de fotones detectados durante los intervalos de integración de píxeles. Adquirimos imágenes en intervalos de tiempo de 3 h durante el ciclo de luz-oscuridad y calculamos la relación entre la intensidad de SHG y el recuento de píxeles de TPF (Fig. 5). Dado que la señal SHG del almidón solo proviene del interior del cloroplasto, utilizamos la cantidad de píxeles TPF para cuantificar las áreas de cloroplasto en una imagen. Por lo tanto, la relación entre intensidad de SHG y píxeles de TPF representa una cantidad relativa de almidón dentro del cloroplasto para diferentes horas ZT. En la Fig. 5, el eje horizontal representa ZT horas, comenzando a las 0 h después del encendido de las luces (ZT0) y avanzando en intervalos de tres horas hasta ZT24. La proporción representa las variaciones del contenido de almidón de las hojas a lo largo de un día. La relación en las hojas Col-0 indica que el contenido de almidón aumenta debido a la fotosíntesis durante las horas de luz y disminuye durante las horas de oscuridad a medida que el almidón se degrada para proporcionar energía. Aunque el mutante sex1 muestra un mayor contenido de almidón durante todo el ciclo de luz-oscuridad, su degradación defectuosa del almidón no conduce a una tendencia a la baja obvia del contenido de almidón durante las horas de oscuridad. Un pequeño fondo distinto de cero observado en la proporción de Col-0 muestra que queda cierta cantidad de almidón al amanecer, pero también puede atribuirse a una pequeña fuga de TPF en la banda de detección de SHG (Fig. 2c). Nuestros datos para las dos líneas de Arabidopsis muestran patrones de almidón similares a los perfilados por ensayos enzimáticos27, sin una preparación prolongada de la muestra ni destrucción de las hojas observadas. Por lo tanto, las imágenes TPF-SHG proporcionan un método mínimamente invasivo para monitorear el contenido de almidón dentro de una hoja con el potencial de monitorear in situ en tiempo real de una hoja durante múltiples ciclos circadianos.

Variaciones diurnas de gránulos de almidón en Arabidopsis con imágenes TPF-SHG. Imágenes TPF (rojo) y SHG (verde) de hojas frescas intactas Col-0 y sexo1 en diferentes horas de Zeitgeber Time (ZT). Para Col-0 se pueden observar variaciones en la intensidad de los SHG para las diferentes horas ZT.

La relación entre la intensidad de SHG y el recuento de píxeles de TPF por encima del umbral en las imágenes se analizó y se representó en un ciclo diurno de 16 h de luz/8 h de oscuridad. El eje horizontal muestra las horas ZT, comenzando a las 0 h después del encendido de la luz (ZT0) e incrementa en intervalos de 3 h hasta ZT24. La barra en la parte superior indica las horas en que la luz de la cámara de crecimiento estuvo encendida y apagada, y la línea discontinua indica la hora ZT16 en que se apagó la luz de la cámara de crecimiento. Las barras de error corresponden a una desviación estándar basada en 12 áreas de imágenes de dos hojas. (ISHG: intensidad sumada para píxeles por encima del umbral SHG de 2; CntTPF: píxeles totales por encima del umbral TPF de 50).

Los métodos actuales para perfilar el contenido de almidón de las hojas para estudios diurnos de plantas requieren generar plantas transgénicas o sacrificar las hojas observadas. Al utilizar imágenes TPF y SHG para monitorear el contenido de almidón de hojas frescas de dos tipos de Arabidopsis, Col-0 y sex1 mutante, durante un ciclo de luz-oscuridad de 24 h, hemos demostrado con éxito la capacidad de cuantificar el contenido de almidón de forma no destructiva para estudios diurnos de hojas frescas. Las imágenes TPF permitieron la visualización del cloroplasto, mientras que las imágenes SHG proporcionaron la distribución espacial del almidón. La adquisición espectral confirmó aún más el origen de las señales TPF y SHG. Dado que este método se realizó en hojas frescas intactas con una preparación mínima de la muestra, puede usarse potencialmente para obtener imágenes in situ en tiempo real. Nuestro método permite el estudio del ritmo circadiano del almidón no solo en una sola hoja sino también en diferentes partes de una hoja hasta una sola célula. Por lo tanto, el almidón en diferentes tipos de células, células en diferentes zonas de desarrollo o cualquier estímulo que cambie las variaciones diurnas del almidón de las hojas se puede estudiar en tiempo real.

Jychian proporcionó amablemente las semillas del tipo silvestre Columbia-0 (Col-0) y el mutante sex1-1 (stock de germoplasma: CS3093 está disponible públicamente en Arabidopsis Biological Resource Center “https://abrc.osu.edu/”). Chen del Instituto de Biología Molecular, Academia Sínica, Taipei28. Todos los estudios de plantas se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes proporcionadas por las respectivas instituciones de los autores y los Centros para el Control de Enfermedades de Taiwán. Primero sembramos las semillas Col-0 o sex1-1 limpiadas con lejía en Murashige y Skoog (1/2 MS) a media potencia con vitaminas (M519, PhytoTech LAB) en placas de fitoagar y colocamos las placas en una cámara de crecimiento (CH202). , CHIN HSIN). Luego, las semillas se incubaron en fotoperíodos de día largo (LD) de 16 h de luz/8 h de oscuridad a 22 °C durante 7 a 24 días. Justo antes de tomar las imágenes, retiramos la placa de la cámara en el tiempo Zeitgeber (ZT) específico y separamos la hoja más grande de la plántula. Luego, la hoja se colocó directamente sobre un portaobjetos de vidrio, se mantuvo húmeda con gotas de agua y se cubrió con un cubreobjetos para obtener imágenes. Para el experimento de variación diurna del almidón, colocamos las placas con las semillas sembradas en dos cámaras de crecimiento separadas (CH202, CHIN HSIN), con el tiempo inicial del fotoperíodo separado por 12 h. Esto nos permitió adquirir datos en ZT de 0 a 24 h en un período de medio día. Obtuvimos imágenes para ZT a partir de las 0 h cuando se encendió la luz por primera vez y procedimos con intervalos de 3 h hasta ZT24.

Las imágenes de TPF y SHG se realizaron en un sistema de escaneo láser personalizado (Photonic Workshop, LSCM 4.0). Este sistema permitió imágenes SHG y TPF en la configuración de detección no escaneada (NDD) e imágenes hiperespectrales en la configuración de detección confocal descanzada (DD). La fuente láser fue un láser pulsado de 300 fs con una tasa de repetición de 40 MHz y una longitud de onda central de 1064 nm (Fianium, FemtoPower 1060-532-s). Una lente objetivo de 20X (Nikon, NA 0,75) enfocó la luz láser con una potencia en la muestra de 23 a 27 mW correspondiente a una intensidad de potencia de 10 mJ/s‧μm2. Se usó un filtro de 670/30 nm para obtener imágenes de clorofila TPF y un filtro de 532/3 nm para obtener imágenes de SHG. Para obtener imágenes hiperespectrales, la señal se recolectó en la configuración DD mediante una fibra de núcleo de 200 μm, luego se envió a un espectrómetro de fibra acoplada (Photonic Workshop, MR-SPEC), que contiene una rejilla de 300 ranuras/mm y un CCD refrigerado por TE ( Andor, iDus).

Dado que los gránulos de almidón se producen en el cloroplasto de las células del mesófilo, cuantificamos el contenido de almidón calculando la relación entre la intensidad de SHG, ISHG, y el recuento de píxeles de TPF, CntTPF, por encima de un umbral para cada dato de imagen. La intensidad de SHG se sumó solo en aquellos píxeles con un recuento de SHG por encima del nivel de fondo de 2, durante un tiempo de integración de 0,128 ms. Para el recuento de píxeles TPF, utilizamos un nivel de umbral de 50. Este valor se determinó empíricamente para delinear mejor la morfología del cloroplasto que se encuentra en el plano focal de la imagen (consulte la Información complementaria para obtener más detalles).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Beck, E. & Ziegler, P. Biosíntesis y degradación del almidón en plantas superiores. Año. Rev. Planta Biol. 40, 95-117 (1989).

Artículo CAS Google Scholar

Buleon, A., Colonna, P., Planchot, V. & Ball, S. Gránulos de almidón: estructura y biosíntesis. En t. J. Biol. Macromol. 23, 85-112 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Zeeman, SC y cols. Síntesis de almidón en arabidopsis. Síntesis, composición y estructura de gránulos. Física de la planta. 129, 516–529 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Chia, T. y col. Se requiere una glucosiltransferasa citosólica para la conversión del almidón en sacarosa en las hojas de Arabidopsis durante la noche. Planta J. 37, 853–863 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Smith, AM, Zeeman, SC y Smith, SM Degradación del almidón. Año. Rev. Planta Biol. 56, 73–98 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M. & Smith, AM Control circadiano de la disponibilidad de carbohidratos para el crecimiento nocturno de plantas de Arabidopsis. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 107, 9458–9463 (2010).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Holm, J., Björck, I., Drews, A. y Asp, NG Un método rápido para el análisis de almidón. Almidón-Stärke 38, 224–226 (1986).

Artículo CAS Google Scholar

Mitchell, GA Métodos de análisis de almidón. Almidón-Stärke 42, 131-134 (1990).

Artículo CAS Google Scholar

Smith, AM & Zeeman, SC Cuantificación de almidón en tejidos vegetales. Nat. Protocolo. 1, 1342-1345. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.232 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Szydlowski, N. y col. La iniciación de los gránulos de almidón en arabidopsis requiere la presencia de almidón sintasas de clase IV o clase III. Célula vegetal 21, 2443–2457. https://doi.org/10.1105/tpc.109.066522 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bahaji, A. et al. Los mutantes de Arabidopsis thaliana que carecen de ADP-glucosa pirofosforilasa acumulan almidón y contenido de ADP-glucosa de tipo salvaje: evidencia adicional de la aparición de fuentes importantes, además de la ADP-glucosa pirofosforilasa, de ADP-glucosa vinculada a la biosíntesis de almidón de hoja. Fisiol de células vegetales. 52, 1162-1176. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr067 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Earles, JM y cols. Cuantificación in vivo de las reservas de almidón vegetal con resolución micrométrica mediante imágenes de microCT de rayos X y aprendizaje automático. Nuevo fitol. 218, 1260–1269. https://doi.org/10.1111/nph.15068 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Zeeman, SC, Kossmann, J. & Smith, AM Almidón: su metabolismo, evolución y modificación biotecnológica en plantas. Año. Rev. Planta Biol. 61, 209–234 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Santelia, D. & Zeeman, SC Progreso en la investigación del almidón de Arabidopsis y posibles aplicaciones biotecnológicas. actual. Opinión. Biotecnología. 22, 271–280 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Seung, D. Amilosa en almidón: hacia una comprensión de la biosíntesis, estructura y función. Nuevo fitol. 228, 1490-1504 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Chu, SW y cols. Efectos de cristales biofotónicos no lineales revelados con microscopía no lineal multimodal. J. Microsc. 208, 190–200 (2002).

Artículo MathSciNet Google Scholar

Zhuo, ZY et al. Imágenes de segunda generación armónica: un nuevo método para desentrañar la información molecular del almidón. J. Estructura. Biol. 171, 88–94. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2010.02.020 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Williams, RM, Zipfel, WR y Webb, WW Microscopía multifotónica en la investigación biológica. actual. Opinión. Química. Biol. 5, 603–608 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Hoover, EE y Squier, JA Avances en la tecnología de microscopía multifotónica. Nat. Fotón. 7, 93-101 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Zipfel, WR, Williams, RM y Webb, WW Magia no lineal: microscopía multifotónica en las biociencias. Nat. Biotecnología. 21, 1368-1376 (2003).

Artículo de Google Scholar

Chen, MI y col. Imágenes multifotónicas para identificar grana, tilacoide del estroma y almidón dentro de una hoja intacta. Bmc Planta Biol. https://doi.org/10.1186/1471-2229-14-175 (2014).

Cox, G., Moreno, N. & Feijo, J. Imágenes del segundo armónico de polisacáridos vegetales. J. Biomed. Óptica https://doi.org/10.1117/1.1896005 (2005).

Artículo de Google Scholar

Mizutani, G. et al. Detección de gránulos de almidón en una planta viva mediante microscopía óptica de segundo armónico. J. Lumin 87–9, 824–826. https://doi.org/10.1016/S0022-2313(99)00428-7 (2000).

Artículo de Google Scholar

Cisek, R. y col. Investigación mediante microscopía de segunda generación armónica de la ultraestructura cristalina de tres líneas de almidón de cebada afectadas por la hidratación. Biomédica. Óptica Express 6, 3694–3700 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Mazumder, N., Yun-Xiang, L., Qiu, J. y Kao, F.-J. Revelación de la estructura molecular del almidón con microscopía de segunda generación armónica basada en vectores Stokes. J. Optics-UK 47, 40–46 (2018).

Artículo de Google Scholar

Psilodimitrakopoulos, S., Amat-Roldan, I., Loza-Alvarez, P. & Artigas, D. Estimación del ángulo de paso helicoidal de la amilopectina en almidón mediante microscopía de polarización de segunda generación armónica. J. Optics-Reino Unido https://doi.org/10.1088/2040-8978/12/8/084007 (2010).

Artículo de Google Scholar

Matsoukas, IG, Massiah, AJ y Thomas, B. El metabolismo del almidón y las señales antiflorigénicas modulan la transición de fase juvenil a adulta en A rabidopsis. Entorno de células vegetales. 36, 1802–1811 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Yu, TS y cols. El mutante sex1 de Arabidopsis tiene un defecto en la proteína R1, un regulador general de la degradación del almidón en las plantas, y no en el transportador de hexosa del cloroplasto. Célula vegetal 13, 1907-1918. https://doi.org/10.1105/tpc.010091 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Los autores agradecen el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán bajo las subvenciones Nos.: MOST 108-2119-M-002 -026 -MY3, MOST 108-2112-M-002 -013 -MY3 y MOST 110- 2628-B-002-052.

Centro de Ciencias de la Materia Condensada, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, 10617, Taiwán

Juo Nang Liao, Wei-Liang Chen, Chao-Yuan Lo, Man-Hong Lai y Yu-Ming Chang

Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, 10617, Taiwán

Juo Nang Liao y Huang Lung Tsai

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Y.-MC y H.-LT concibieron y diseñaron la investigación. J.-NL y W.-LC realizaron experimentos. J.-NL y C.-YL analizaron los datos. M.-HL, W.-LC e Y.-MC construyeron el sistema de imágenes. J.-NL y W.-LC escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Huang-Lung Tsai o Yu-Ming Chang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Liao, JN., Chen, WL., Lo, CY. et al. Perfil circadiano no destructivo del contenido de almidón en hojas frescas intactas de Arabidopsis con fluorescencia de dos fotones e imágenes de generación de segundo armónico. Informe científico 12, 16525 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20618-5

Descargar cita

Recibido: 30 de mayo de 2022

Aceptado: 15 de septiembre de 2022

Publicado: 03 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20618-5

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.

Blog

Perfil circadiano no destructivo del contenido de almidón en hojas frescas intactas de Arabidopsis con dos