El sistema eINTACT analiza la explotación bacteriana de la osmoseñalización de las plantas para mejorar la virulencia

Nature Plants volumen 9, páginas 128–141 (2023)Cite este artículo

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Las bacterias inyectan proteínas efectoras en las células huésped para manipular los procesos celulares que promueven la enfermedad. Dado que las bacterias administran cantidades minúsculas de efectores solo a las células huésped específicas, es técnicamente un desafío capturar los cambios celulares dependientes de los efectores de los tejidos del huésped infectados en masa. Aquí, presentamos una nueva técnica llamada aislamiento inducible por efectores de núcleos etiquetados en tipos de células específicas (eINTACT), que facilita la purificación basada en afinidad de núcleos de células vegetales de Arabidopsis que han recibido efectores bacterianos de Xanthomonas. El análisis de núcleos purificados revela que el efector XopD de Xanthomonas manipula la expresión de genes relacionados con la señalización del ácido abscísico de Arabidopsis y activa OSCA1.1, un gen que codifica un canal permeable al calcio necesario para el cierre de los estomas en respuesta al estrés osmótico. La pérdida de OSCA1.1 provoca el marchitamiento de las hojas y una reducción del crecimiento bacteriano en las hojas infectadas, lo que sugiere que OSCA1.1 promueve la susceptibilidad del huésped. eINTACT nos permite descubrir que XopD aprovecha el cierre estomático mediado por osmoseñalización del huésped OSCA1.1/ácido abscísico para crear un hábitat húmedo que favorece el crecimiento bacteriano y abre una nueva vía para dilucidar con precisión las funciones de los efectores de numerosas bacterias vegetales gramnegativas en especies nativas. contextos de infección.

Los patógenos bacterianos ingresan a las plantas hospedantes a través de aberturas naturales (por ejemplo, estomas o hidatodos) o heridas y posteriormente se multiplican en el espacio apoplásico entre las células o en los vasos1,2. Para facilitar la infección, las bacterias gramnegativas virulentas inyectan efectores en las células huésped utilizando un complejo multiproteico similar a una jeringa, el sistema de secreción tipo III (T3SS)3. Dentro de las células huésped, los efectores se localizan en compartimentos subcelulares específicos y manipulan los procesos celulares del huésped para suprimir la inmunidad del huésped y/o crear un entorno que favorezca el crecimiento o la dispersión bacteriana4,5. Estudios recientes sobre patógenos bacterianos sugieren que el establecimiento de un espacio apoplástico acuoso en las plantas es fundamental para la virulencia bacteriana6. De hecho, se identificaron algunos efectores que promueven la enfermedad al provocar un aumento de los niveles de agua en los tejidos infectados, como Pseudomonas syringae HopM16, Xanthomonas gardneri AvrHah17 y Xanthomonas translucens Tal88. Debido a la diversidad de efectores en géneros bacterianos filogenéticamente distintos, los mecanismos moleculares que subyacen a la susceptibilidad de las plantas mediada por efectores siguen siendo en gran medida enigmáticos.

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004 (Xcc8004) es un patógeno vascular foliar que causa la pudrición negra en muchos cultivos de Brassica y en la planta modelo Arabidopsis2. Una de sus proteínas efectoras, la proteína D externa de Xanthomonas (XopDXcc8004, en este estudio, XopD), es una proteína efectora de tipo III localizada en el núcleo que contiene tres represión anfifílica asociada al factor de unión al elemento sensible al etileno N-terminal específico de la planta. motivos que generalmente median el silenciamiento transcripcional en planta y un dominio de cisteína proteasa C-terminal9 (Datos ampliados, figura 1). Curiosamente, dos estudios previos informaron distintas actividades de XopD en Arabidopsis10,11. Un estudio demostró que XopD promueve la enfermedad al suprimir la necrosis foliar temprana, pero no afecta el crecimiento bacteriano en las hojas infectadas de Arabidopsis10. A través de su dominio que contiene el motivo EAR, XopD interactúa y estabiliza las proteínas de Arabidopsis DELLA que son los principales represores transcripcionales de los genes que responden al ácido giberélico (GA)10. Sin embargo, la interacción XopD-DELLA no causa cambios detectables en los niveles de transcripciones que responden a GA10. De manera controvertida, otro estudio infirió un efecto de avirulencia de XopD, ya que la expresión transgénica de XopD bajo el control de un promotor inducible por β-estradiol en Arabidopsis desencadenó respuestas de defensa dependientes del ácido salicílico (SA) y suprimió el crecimiento bacteriano11. Además, al tener una pequeña actividad de proteasa modificadora similar a la ubiquitina (SUMO), se ha descubierto, in vitro, que XopD interactúa y deSUMOila Arabidopsis HFR1, un factor de transcripción (TF) implicado en la señalización de fitocromos11. En conjunto, ambos estudios previos se prestan a sugerir que XopD podría modular la actividad de los TF de las plantas y las vías de señalización de las fitohormonas del huésped. No obstante, los mecanismos moleculares que subyacen a las funciones precisas in planta de XopD siguen sin ser concluyentes.

Buscamos identificar y caracterizar estos mecanismos moleculares ambiguos; sin embargo, los enfoques experimentales actuales que tienen como objetivo descubrir las funciones de los efectores bacterianos en las plantas ignoran en su mayoría la complejidad celular de los tejidos vegetales infectados. Por ejemplo, después de entrar en el espacio apoplásico del mesófilo, los patógenos bacterianos inyectan sus efectores sólo en las células vegetales a las que se puede acceder desde la luz apoplásica3. Las células vecinas pueden recibir algunos efectores que se mueven desde las células que reciben directamente efectores a través de los plasmodesmos; sin embargo, es probable que el gradiente de concentración sea pronunciado12. Posiblemente, los cambios inducidos por efectores en esas células vecinas difieran cuantitativamente dependiendo de las funciones y cantidades de los efectores específicos que se mueven a través de los plasmodesmos. Actualmente, la mayoría de los estudios utilizan tejidos del huésped infectados en masa como material de partida, que consisten en una mezcla de células huésped efectoras-receptoras y no receptoras, lo que inevitablemente causa una dilución de los cambios celulares inducidos por los efectores, posiblemente a niveles indetectables. Alternativamente, la expresión transgénica de genes efectores bajo promotores constitutivos o inducibles se usa comúnmente para aproximar sus funciones in planta. Si bien es simple y útil, la sobreexpresión ectópica de efectores en plantas ignora el hecho de que las bacterias generalmente entregan solo cantidades minúsculas de proteínas efectoras a las células huésped objetivo, posiblemente oscureciendo las funciones efectoras que son sensibles a la dependencia de la dosis, la dinámica de infección espacio-temporal y la especificidad celular. ,13,14. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevas técnicas experimentales que permitan el análisis de las funciones efectoras bacterianas en las células que reciben directamente los efectores mediante la administración mediada por T3SS en tejidos del huésped infectados de forma nativa.

Para superar las limitaciones técnicas de los métodos utilizados actualmente para el análisis funcional de efectores in planta, hemos desarrollado una nueva técnica, el aislamiento inducible por efectores de núcleos marcados en tipos celulares específicos (eINTACT), para recuperar selectivamente núcleos de células efectoras-receptoras de células infectadas. Plantas de Arabidopsis (Fig. 1a, b). eINTACT se basa en la activación transcripcional de una proteína dirigida a la envoltura nuclear (NTF) biotinilada codificada por un transgén15,16,17 mediante efectores que las bacterias inyectan en las células diana de las plantas. En la línea Arabidopsis reportera eINTACT recientemente establecida, la expresión del transgén NTF está bajo el control del promotor transcripcionalmente silencioso del gen Bs3 de la pimienta (Bs3p) que es activado por el activador de la transcripción bacteriana (TAL) efector AvrBs3 de Xanthomonas euvesicatoria (Xe )18. El patógeno bacteriano Xcc se utiliza para administrar AvrBs3 en las células de Arabidopsis para activar el indicador NTF. Para generar una cepa derivada de Xcc que sea completamente virulenta en Arabidopsis, llamada Xcc*, eliminamos los genes bacterianos que codifican los efectores AvrAC y XopAM que se sabe que desencadenan inmunidad en la adhesión de Arabidopsis Col-019. Transformamos Xcc* con un vector pDSK que contiene avrBs3 bajo el control de un promotor constitutivo, produciendo Xcc*AvrBs3. Por lo tanto, Xcc*AvrBs3 entregará AvrBs3 junto con otros efectores Xcc* en la línea informadora eINTACT de Arabidopsis, lo que conducirá a la activación transcripcional de Bs3p y a la expresión del NTF posterior exclusivamente en células huésped efectoras-receptoras. Una biotina ligasa codificada por un transgén y expresada constitutivamente media en el marcaje con biotina de la proteína NTF, facilitando la purificación por afinidad de núcleos decorados con biotina a partir de células huésped efectoras utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina como se describe en el método INTACT15,16,17 (Fig. 1b).

a, Esquema del sistema Arabidopsis-Xcc eINTACT (Texto complementario). b, Aislamiento de los núcleos marcados con biotina utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina mediante purificación basada en afinidad (método INTACT, texto complementario). c, Detección por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) de la expresión de NTF en hojas infectadas con Xcc*vec1 y Xcc*AvrBs3, siete días después de la infección (DPI). La expresión de TUB2 se utiliza como control. d – f, Imágenes de microscopía de células de hojas que han recibido efectores Xcc*AvrBs3. Barra de escala, 50 μm. g – i Imágenes de microscopía de núcleos purificados con eINTACT (indicados con triángulos blancos) de hojas infectadas con Xcc*AvrBs3. Barra de escala, 100 μm. En imágenes de microscopía, BF indica campo brillante (d,g); las cuentas magnéticas aparecen como esferas blancas (g); El ADN teñido con DAPI se muestra en azul (e,h); y los dominios de la envoltura nuclear marcados con NTF rojo se detectan mediante fluorescencia de mCherry (f,i). Se realizaron tres repeticiones de cada experimento (c – i) de forma independiente con resultados similares.

Como prueba de concepto, inoculamos la línea informadora eINTACT con Xcc*AvrBs3 y una cepa isogénica que contiene el vector pDSK vacío sin avrBs3 (Xcc*vec1). Debido a que Xcc es un patógeno vascular, en nuestro estudio inoculamos las hojas de Arabidopsis hiriendo la vena central de la hoja con una aguja contaminada con Xcc19. Siete días después de la infección (DPI), detectamos acumulación de ARNm de NTF solo en Xcc * AvrBs3, pero no en Xcc * vec1, hojas inoculadas (Fig. 1c), lo que demuestra que la expresión de NTF depende estrictamente de AvrBs3. Además, la inspección microscópica de las hojas infectadas con Xcc * AvrBs3 reveló una proteína NTF fluorescente de color rojo en las envolturas nucleares de las células efectoras-receptoras (Fig. 1d-f), y la transferencia Western mostró un enriquecimiento de la proteína NTF en los núcleos purificados con eINTACT (Datos ampliados Figura 2a). Además, las hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 de la línea informadora eINTACT desarrollaron síntomas normales de la enfermedad de clorosis en forma de V y albergaron una cantidad similar de población bacteriana que las hojas Col-0 de tipo salvaje infectadas con Xcc*vec1 (Datos ampliados, figuras 2b y c). Nuestros resultados demuestran que el sistema eINTACT está cerca de las condiciones de infección nativas y proporciona una base experimental para recuperar específicamente núcleos de células huésped efectoras-receptoras de hojas infectadas con Xcc * AvrBs3 (Fig. 1g-i).

Para estudiar las funciones de la planta del efector XopD con objetivo nuclear, inoculamos hojas de la línea informadora eINTACT con Xcc*AvrBs3 que expresa XopD o el correspondiente mutante de eliminación de xopD Xcc∆xopD*AvrBs3. A los cinco DPI, las hojas infectadas con Xcc∆xopD*AvrBs3 comenzaron a mostrar lesiones de marchitamiento, que progresaron a síntomas de deshidratación y necrótica en la etapa tardía de la infección (siete DPI); mientras que las hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 desarrollaron síntomas de enfermedad amarillos en forma de V, lo que indica que XopD altera los síntomas de la enfermedad y promueve la proliferación bacteriana en las hojas infectadas (Fig. 2a). Por lo tanto, con nuestro sistema eINTACT, purificamos núcleos que recibieron XopD (nuc+XopD) o no recibieron XopD (nuc-XopD) de hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 y Xcc∆xopD*AvrBs3, respectivamente, a cinco DPI. El análisis diferencial de nuc+XopD versus nuc-XopD proporcionó la base para descubrir cambios desencadenados por XopD en los núcleos de las células huésped efectoras-receptoras.

a, Hojas representativas de Arabidopsis infectadas con Xcc∆xopD*AvrBs3 (−XopD) y Xcc*AvrBs3 (+XopD) a cinco y siete DPI. b, Red de concepto genético que representa las conexiones entre los DEG dependientes de XopD y sus términos GO biológicos enriquecidos significativamente (FDR <0,05; enriquecimiento veces> 2). No se mostraron los DEG que no estaban anotados por estos términos GO. c, Instantáneas del navegador de epigenomas WashU que muestran los niveles de metilación de mCG y mCHH en los loci SUVH9 y OSCA1.1. Las barras positivas y negativas indican niveles de 5-metilcitosina de citosina única en las cadenas de Watson (+1) y Crick (-1), respectivamente. Los elementos transponibles (TE) se muestran como cuadros grises. El sitio de inicio de la transcripción (TSS) se indica con un triángulo marrón. d, e, Los niveles de expresión (recuentos medios de lectura) de OSCA1.1 (d) y PR1, PR2, PR5, EDS1 y PAD4 (e) en nuc-XopD y nuc+XopD. Los datos se presentan como valores medios ± sem (barras de error) de n = 3 réplicas biológicas independientes. Los valores de DESeq2 P provienen de la prueba de Wald corregida para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0,033; PR1, P = 0,819; PR2, P = 0,947; PR5, P = 0,794; EDS1, P = 0,833; PAD4, P = 0,981). *P < 0,05; NS, no significativo (P > 0,05). f, Expresión relativa de XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 y HYL1 después de que XopD fuera inducida por β-estradiol en plántulas de Arabidopsis, en relación con su expresión en plántulas tratadas con DMSO. La expresión de TUB2 se utiliza como control. Los datos se presentan como valores medios ± sed (barras de error) de n = 2 réplicas biológicas independientes. La significación estadística se determina mediante una prueba t no apareada bilateral (plántulas tratadas con DMSO versus plántulas tratadas con β-estradiol; XopD, P = 0,04; PR1, P = 0,04; PR2, P = 0,03; OSCA1.1, P = 0,42; HYL1, P = 0,15). *P < 0,05; NS, no significativo (P > 0,05). Los círculos pequeños indican puntos de datos de réplicas biológicas individuales (d – f).

Datos fuente

La comparación de transcriptomas nucleares en nuc+XopD versus nuc-XopD mediante secuenciación de ARN identificó 924 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) (Tabla complementaria 1). El análisis de ontología genética (GO) reveló que estos DEG se enriquecieron significativamente en las transcripciones involucradas en las funciones de "silenciamiento de genes", "regulación negativa de la expresión génica", "desarrollo de gametofitos" y "aminoacilación de ARNt" (Fig. 2b y Tabla complementaria 2). Específicamente, el análisis GO reveló 13 DEG que codifican componentes importantes de la metilación del ADN dirigida por ARN o de pequeñas vías de silenciamiento de ARN, que se sabe predominantemente que afectan el silenciamiento de genes a través de la regulación epigenética y la interferencia de ARN, respectivamente (Tabla 1). Esto sugiere que los cambios dependientes de XopD en la expresión del gen del huésped podrían, al menos en parte, regularse a nivel epigenético.

Por lo tanto, investigamos los cambios dependientes de XopD en la metilación del ADN de todo el genoma en las citosinas (mC) (Datos ampliados, figura 3 y tabla complementaria 3) y su correlación con los cambios transcripcionales en nuc+XopD versus nuc-XopD. Identificamos 19 DEG que se correlacionaban con regiones metiladas diferencialmente (DMR) dentro de sus regiones promotoras proximales de 3 kb (Tabla complementaria 4). Estos 19 DEG incluyen, por ejemplo, SUVH9 que codifica una histona metiltransferasa20 y OSCA1.1 que codifica una proteína del canal permeable al Ca2+ implicada en el cierre de estomas inducido por estrés osmótico en Arabidopsis21. XopD provocó niveles reducidos de mCG en el promotor SUVH9 y niveles reducidos de mCHH en el promotor OSCA1.1 (Fig. 2c). Dado que el aumento de la metilación del promotor generalmente se correlaciona con la transcripción reducida de los genes posteriores20, nuestros resultados indican que los niveles elevados de transcripción de SUVH9 y OSCA1.1 (Tabla 1 y Fig. 2d) son probablemente la consecuencia de la desmetilación de sus promotores inducida por XopD (Fig. 2c). ).

Un estudio previo demostró que la expresión in planta de XopD bajo el control de un promotor inducible por β-estradiol desencadenó una respuesta de defensa mediada por SA en Arabidopsis11. Por el contrario, nuestra investigación, que se basa en un escenario de infección nativa en el que el patógeno bacteriano Xcc inyecta XopD en células huésped específicas, no descubrió cambios en la abundancia de la transcripción de genes clave dependientes de SA (Fig. 2e y Tabla complementaria 5). Las discrepancias entre los dos estudios no se limitan a los genes relacionados con SA. Además, no encontramos ninguna superposición entre los DEG dependientes de XopD en nuestros datos de eINTACT y los genes cuyos niveles de transcripción cambiaron después de que XopD fuera inducido por β-estradiol11. Por ejemplo, tanto OSCA1.1 como HYL1, que tenían cambios de expresión dependientes de XopD en las células efectoras-receptoras (Fig. 2d y Tabla 1), no cambiaron en la expresión después de la inducción de XopD con β-estradiol en plántulas de Arabidopsis ( Figura 2f).

Durante la infección, la administración mediada por Xcc*AvrBs3 T3SS da como resultado trazas de XopD solo en las células huésped que son el objetivo de las bacterias4,13,14. Sin embargo, la expresión ectópica inducida por β-estradiol causa niveles altos de XopD en todas las células vegetales, lo que posiblemente exacerba su actividad in planta, lo que resulta en una mala regulación de la expresión genética y la fisiología de la planta de una manera que no refleja una infección natural. Como tal, se demostró previamente que la expresión inducida de XopD en Arabidopsis causó manchas necróticas localizadas y muerte celular en las hojas11, mientras que las bacterias nativas inyectan XopD para suprimir la necrosis de las hojas (Fig. 2a). Estas discrepancias observadas abogan por la necesidad de estudiar las funciones efectoras en un sistema de infección que sea lo más cercano posible a las condiciones nativas.

Para aclarar si nuestro estudio específico de células efectoras-receptoras realmente mejoró el descubrimiento de cambios de expresión dependientes de XopD, realizamos un análisis de expresión génica diferencial utilizando tejidos de hojas completas infectadas con Xcc*AvrBs3 versus Xcc∆xopD*AvrBs3 como materiales de partida (Datos ampliados Figura 4). No observamos cambios en los niveles de transcripción de NRPD1A, DDM1, HYL1, DWA1 y OSCA1.1 en tejidos foliares infectados completos (Datos ampliados, Fig. 4); aunque algunos de estos cambios siguieron tendencias similares a las comparaciones de nuc+XopD versus nuc-XopD (Tabla 1), las diferencias fueron mucho más pequeñas y no significativas (Datos ampliados, Fig. 4). Estas observaciones indican que los cambios de expresión dependientes de XopD descubiertos en los núcleos efectores-receptores se diluyen a niveles no significativos si se analizan en tejidos de hojas infectados en masa, lo que demuestra el poder de nuestro enfoque eINTACT.

Dado que se descubrió que OSCA1.1 tiene un aumento en la expresión dependiente de XopD (Fig. 2d), se plantea la cuestión de la relevancia biológica de la inducción de OSCA1.1 para la virulencia de Xcc.

OSCA1.1 es una proteína de canal permeable a Ca2+ localizada en la membrana plasmática que actúa como osmosensor en Arabidopsis21. Las mutaciones en OSCA1.1 causan aumentos alterados de Ca2+ y falla en el cierre de los estomas ante el estrés osmótico21. Para evaluar si OSCA1.1 desempeña o no un papel en la infección por Xcc, obtuvimos osca1-1, un mutante nulo que contiene dos sustituciones de aminoácidos que resultan en la pérdida de la función OSCA1.121 (Fig. 3a). Inoculamos las plantas osca1-1 y las plantas de control de tipo salvaje (Col-0) con Xcc* que expresa XopD. Observamos que las hojas de osca1-1 infectadas tenían un grado significativamente menor de síntomas de la enfermedad de clorosis en forma de V y albergaban una población bacteriana reducida en comparación con los controles Col-0 infectados (Fig. 3b, c y Datos ampliados Fig. 5). En la etapa tardía de la infección (nueve DPI), las hojas infectadas de osca1-1 mostraron marchitez y necrosis del tejido, en contraste con los síntomas de la enfermedad clorótica en las hojas infectadas de Col-0 (Fig. 3d). Además, inoculamos bacterias Xcc* en las hojas de una línea transgénica previamente establecida que expresa OSCA1.1 bajo el control de un promotor 35S en el fondo mutante osca1-1 (Pro35S:OSCA1.1/osca1-1), donde la expresión constitutiva de OSCA1.1 complementa la señalización osmótica alterada de Ca2+ en el mutante osca1-1 en respuesta al estrés osmótico21. Observamos que el grado de los síntomas de la enfermedad y la cantidad de población bacteriana en las hojas infectadas de Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 eran significativamente mayores en comparación con las hojas infectadas de osca1-1, pero aún menores en comparación con los controles infectados de Col-0. (Datos ampliados Fig. 6). En resumen, estos resultados demuestran que OSCA1.1 es importante para las enfermedades bacterianas y la supresión de la necrosis foliar dependiente de XopD, y la activación transcripcional de OSCA1.1 en células bacterianas dirigidas a efectores puede ser necesaria para una susceptibilidad óptima del huésped.

a, Modelo genético de OSCA1.1 que muestra las posiciones de las dos sustituciones de aminoácidos en el mutante osca1-1. b, Un diagrama de caja que representa las puntuaciones del índice de enfermedad (0, sin síntomas; 0,5 a 1,5, clorosis débil; 2 a 3, clorosis fuerte) de n = 40 de cada una de las hojas de osca1-1 o Col-0 infectadas con Xcc* de ocho plantas individuales , a siete DPI. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (osca1-1 versus Col-0, P = 1,72e-5). ***P < 0,001. c, Un diagrama de caja que representa la densidad de población bacteriana en n = 23 osca1-1 o n = 24 Col-0 hojas infectadas con Xcc* de ocho plantas diferentes, a siete DPI. UFC, unidades formadoras de colonias. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (osca1-1 versus Col-0, P = 0,0013). **P<0,01. d, el Representante Xcc* inoculó hojas de osca1-1 y Col-0 a nueve DPI. e, Expresión relativa de OSCA1.1 en hojas Col-0 infiltradas con Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1) y Xcc∆xopD*dTALE#2 (dTALE#2), relativa a su expresión en Xcc∆xopD* vec2 (vector) hojas infiltradas, a un DPI. La expresión de TUB2 se utiliza como control. Los datos se presentan como valores medios ± sd (barras de error) de n = 3 réplicas biológicas independientes. Pequeños círculos, puntos de datos de réplicas biológicas individuales. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (dTALE#1 versus vector, P = 0,021; dTALE#2 versus vector, P = 0,045). *P<0,05. f,g, Imágenes de microscopía de las células del pavimento epidérmico y las células protectoras que expresan OSCA1.1-GFP en la membrana plasmática en Xcc∆xopD*vec2 (vector) (f) y Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1) ( g) hojas inoculadas de la línea transgénica ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP a cinco DPI. Las células efectoras-receptoras están indicadas con triángulos blancos. Los experimentos se repitieron dos veces de forma independiente con resultados similares. h, diagrama de caja que representa la densidad de población bacteriana en hojas Col-0 inoculadas con cepas Xcc∆xopD* (−XopD) y Xcc* (+XopD) que liberan un vector vacío (vector), dTALE#1 o dTALE#2, a siete DPI. . Para cada cepa bacteriana, se examinaron n = 12 hojas infectadas de cuatro plantas individuales. Las diferencias entre las poblaciones bacterianas de todas las cepas bacterianas no fueron significativas (prueba ANOVA unidireccional). i, Hojas representativas utilizadas en (h). En los diagramas de caja (b,c,h), las líneas horizontales desde la parte superior muestran valores máximos, cuartil superior, mediana, cuartil inferior y mínimos; las marcas cruzadas muestran los valores medios; y los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales.

Datos fuente

Para examinar si la función de virulencia de XopD in planta se basa únicamente en la inducción de OSCA1.1, construimos dos efectores TAL de diseño (dTALe) que activan transcripcionalmente el promotor OSCA1.1 (Datos extendidos, Fig. 7a). Transformamos los plásmidos que codifican estos dTALE en el mutante con deleción de xopD Xcc∆xopD* e infectamos los transformantes correspondientes (Xcc∆xopD*dTALE#1 y Xcc∆xopD*dTALE#2) en las hojas de una línea transgénica que expresa OSCA1.1- GFP bajo control del promotor OSCA1.1 (ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) y la inmunotransferencia confirmaron niveles elevados de transcripciones OSCA1.1 (Fig. 3e) y OSCA1.1-GFP (Datos extendidos Fig. 7b, c), respectivamente, lo que indica expresión dependiente de dTALE. activación de OSCA1.1 en células dirigidas a efectores. Además, la inspección microscópica reveló OSCA1.1-GFP altamente inducida en la membrana plasmática de las células del pavimento epidérmico y las células protectoras adyacentes, lo que sugiere que estas células recibieron efectores bacterianos (Fig. 3f, g). Sin embargo, la sobreexpresión de OSCA1.1 inducida por dTALE no aumentó la susceptibilidad del huésped a Xcc∆xopD* ni a Xcc* (Fig. 3h), y no fue suficiente para suprimir los síntomas de marchitez y necrótica en las hojas infectadas con Xcc∆xopD* (Fig. .3i). Esto indica que la regulación positiva tanto transcripcional como traduccional de las actividades de OSCA1.1 es necesaria pero no suficiente para la patogénesis bacteriana mediada por XopD.

¿Cuáles podrían ser los factores susceptibles del huésped aún desconocidos que actúan en conjunto con OSCA1.1 en la virulencia bacteriana mediada por XopD? Nuestros datos de eINTACT también descubrieron muchos DEG que participan en la regulación de las respuestas del ácido abscísico (ABA) de Arabidopsis (Fig. 4a). Por ejemplo, los genes inducidos por XopD incluían MYB124 que codifica un MYB TF necesario para el desarrollo estomático y el cierre estomático mediado por ABA22; AIB codifica un bHLH TF que activa la transcripción de genes que responden a ABA23; y ABI8 y GOLS2 codifican ambos reguladores positivos de las respuestas ABA24,25. En particular, el gen principal RD29A26 que responde a ABA tuvo un aumento de aproximadamente cuatro veces en los niveles de transcripción en nuc + XopD (Fig. 4a), lo que sugiere que XopD mejora la respuesta de ABA. Sin embargo, el cambio de expresión de RD29A en nuestros datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) no fue estadísticamente significativo después de la corrección para pruebas múltiples (Fig. 4a). Dado que no podemos descartar que nuestro método RNA-seq de entrada ultrabaja, que implica la amplificación de ADNc en dos pasos, pueda aumentar la variabilidad entre réplicas biológicas, cuantificamos las transcripciones de RD29A en nuc+XopD frente a nuc-XopD mediante RT-qPCR (Fig. 4b). De hecho, los resultados de RT-qPCR mostraron un aumento significativo de las transcripciones de RD29A (Fig. 4b) y confirmaron resultados anteriores de nuestro análisis de RNA-seq (Fig. 4a), demostrando así la reproducibilidad del método eINTACT.

a, Los niveles de expresión (recuentos medios de lectura) de genes que responden a ABA en nuc-XopD y nuc+XopD. Los datos se presentan como valores medios ± sem (barras de error) de n = 3 réplicas biológicas independientes. Los valores de DESeq2 P provienen de pruebas de Wald corregidas para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg (nuc−XopD versus nuc+XopD; RD29A, P = 0,216; MYB33, P = 0,011; ABI8, P = 0,048; AIB, P = 0,046; GOLS2, P = 0,000; MYB124, P = 0,024; CIPK15, P = 0,033; CBL9, P = 0,035). *P < 0,05, ***P < 0,001, NS, no significativo (P > 0,05). b, análisis RT-qPCR de la expresión de RD29A en nuc+XopD en relación con su expresión en nuc-XopD. La expresión de TUB2 se utiliza como control. Los datos se presentan como valores medios ± sd (barras de error) de n = 3 réplicas biológicas independientes. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (P = 0,043). *P<0,05. c, Abundancias relativas de miR159a en nuc-XopD y nuc+XopD en comparación con su abundancia en los núcleos totales de hojas inoculadas simuladamente. Los datos se presentan como valores medios ± sd (barras de error) de n = 3 réplicas biológicas independientes y se normalizan frente a las abundancias de ACTIN2/8 en cada muestra. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (nuc-XopD versus nuc+XopD, P = 0,019). *P<0,05. d, Hojas representativas infectadas con las cepas bacterianas indicadas en condiciones de humedad regulares (60%) o altas (95%) a siete DPI. Simulacro, tratamiento con tampón; ABA, tratamiento con ABA. e, La tasa de pérdida de agua de hojas infectadas desprendidas Xcc* (+XopD) y Xcc∆xopD* (−XopD) a siete DPI. Los datos se presentan como valores medios ± sd (barras de error) de n = 8 hojas de cuatro plantas diferentes. f, Un diagrama de caja que representa la densidad de población bacteriana en tejidos foliares sintomáticos inoculados con Xcc* (+XopD) y Xcc∆xopD* (−XopD) a siete DPI. Las líneas horizontales desde la parte superior muestran valores máximos, cuartil superior, mediana, cuartil inferior y mínimos, y las marcas cruzadas muestran los valores medios. Para cada tratamiento se examinaron n = 8 hojas de cuatro plantas diferentes. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (sin tratamiento: hojas inoculadas con Xcc∆xopD* versus hojas inoculadas con Xcc*, P = 0,046; hojas inoculadas con Xcc∆xopD*: tratamiento simulado versus tratamiento con ABA, P = 0,014) . *P<0,05. Los círculos pequeños (a – c, f) representan puntos de datos de réplicas biológicas individuales.

Datos fuente

Encontramos en nuc+XopD no solo una mayor expresión de los reguladores positivos de las respuestas de ABA sino que, recíprocamente, también disminuyó la expresión de varios genes que codifican reguladores negativos de la señalización de ABA, por ejemplo, CIPK15 y CBL9, los cuales actúan como sensores de Ca2+ que modulan negativamente ABA. sensibilidad y biosíntesis27,28. Tanto las plantas mutantes cipk15 como cbl9 son hipersensibles a ABA y muestran una mayor expresión de genes que responden a ABA y un cierre estomático mejorado27,28. De manera similar, se encontró una expresión reducida en nuc+XopD para los pequeños procesadores de ARN DWA1 y HYL (Tabla 1), que desempeñan un papel negativo en la regulación de la señalización de ABA29,30. La aplicación exógena de ABA induce la hiperexpresión de genes que responden a ABA en plantas mutantes dwa130, y HYL1 reprime el gen inducible por ABA MYB33 mediante el silenciamiento del gen mediado por miR159a29,31,32. Para examinar el efecto de la expresión de HYL1 regulada a la baja en nuc+XopD, cuantificamos la abundancia de miR159a en nuc-XopD y nuc+XopD mediante RT-qPCR de tallo-loop. Descubrimos que la abundancia de miR159a era notablemente (> seis veces) menor en nuc + XopD (Fig. 4c), lo que coincidió con un aumento significativo en la expresión de MYB33 en estos núcleos (Fig. 4a).

Los datos antes mencionados indican que XopD manipula la expresión de reguladores positivos y negativos de la señalización de ABA, lo que es consistente con un modelo de trabajo en el que XopD induce respuestas de ABA en células huésped efectoras-receptoras. Además, no descubrimos una diferencia significativa en los niveles de ABA entre las hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 y XccΔxopD*AvrBs3 mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) (Datos ampliados, Fig. 8), lo que sugiere que XopD potencia las respuestas de señalización de ABA en lugar de aumentando el contenido de ABA.

Es de destacar que el ABA induce el cierre de los estomas para prevenir la pérdida de agua en respuesta al estrés por sequía33. Por lo tanto, la manipulación de la señalización de ABA por parte de XopD podría inducir el cierre de los estomas, lo que daría como resultado una mayor disponibilidad de agua en el apoplasto para promover el crecimiento bacteriano. En apoyo de esta hipótesis, los estudios microscópicos revelaron que las células del pavimento epidérmico y las células protectoras adyacentes que participan en la regulación del cierre estomático recibieron efectores (Figs. 1d-f, 3g). Además, la aplicación exógena de ABA o alta humedad (95%) fue suficiente para suprimir el marchitamiento de las hojas y la necrosis temprana inducida por la infección Xcc∆xopD* (Fig. 4d). Finalmente, XopD inhibió la pérdida de agua en hojas desprendidas infectadas con Xcc * (Fig. 4e), lo que respalda la idea de que XopD induce el cierre de los estomas. En este contexto, vale la pena recordar que OSCA1.1 es crucial para el cierre de los estomas ante el estrés osmótico21 y es necesario para la supresión de la necrosis foliar dependiente de XopD (Fig. 3d). Por lo tanto, los síntomas de marchitez y necrótica y la baja infección bacteriana en las hojas de osca1-1 (Fig. 3b-d) probablemente fueron causados ​​por la falta de cierre de los estomas, lo que resultó en la deshidratación del tejido infectado que no soporta el crecimiento bacteriano.

Después de ingresar a las hojas a través de heridas o hidatodos, las bacterias Xcc avanzan rápidamente hacia los vasos del xilema, lo que provoca infecciones vasculares sistémicas y, finalmente, adoptan un estilo de vida necrotrófico. Esto da como resultado la digestión de los tejidos vasculares y la colonización del apoplasto del mesófilo para causar la enfermedad de podredumbre negra2. Dado que XopD no promueve el crecimiento bacteriano a nivel de toda la hoja (Datos ampliados, Fig. 9) pero suprime los síntomas de marchitamiento y necrótico en las últimas etapas de la infección, planteamos la hipótesis de que XopD induce el cierre de los estomas de una manera controlada espacio-temporalmente para aumentar niveles de agua en el apoplasto después de que Xcc se haya extendido fuera de los vasos del xilema de la planta hacia el apoplasto del mesófilo en los tejidos sintomáticos. La degradación de los vasos del xilema provoca una grave escasez de agua en las hojas y, en consecuencia, el cierre estomático mediado por XopD inhibe la deshidratación del espacio apoplásico. Proponemos que la actividad regulada espacio-temporalmente de XopD facilita la proliferación bacteriana prolongada durante la fase necrotrófica de la infección (Figs. 4f, 5).

En la etapa tardía de la infección, las bacterias Xcc (bastones de color púrpura) atraviesan los vasos del xilema de la planta y ingresan al espacio del apoplasto del mesófilo en los tejidos sintomáticos, donde obtienen acceso a las células que están conectadas al apoplasto y al simplasto, como las células del mesófilo. células del pavimento epidérmico y sus células protectoras vecinas, y entregan efectores a estas células. En las células receptoras de XopD (rojo), XopD promueve la expresión de genes que responden a ABA (por ejemplo, RD29A) posiblemente controlando las funciones de los TF que interactúan con DELLA a través de su actividad de proteasa SUMO y activa la expresión de OSCA1.1 que se correlaciona con la desmetilación de Promotor OSCA1.1. La promoción dependiente de XopD de la singularización de ABA y el aumento de Ca2+ mediado por OSCA1.1 induce un cierre estomático estable para establecer un espacio apoplástico acuoso que apoya el crecimiento bacteriano. Las flechas azules indican señales intercelulares, como Ca2+, miARN y hormonas. El complejo XopD – DELLA – TF propuesto está sombreado en gris.

Nuestro estudio revela un mecanismo previamente desconocido en el que la proteína efectora XopD de Xanthomonas, dirigida al núcleo nuclear, manipula el cierre estomático mediado por OSCA1.1/ABA del huésped para crear un hábitat húmedo que favorece la proliferación bacteriana. En particular, mostramos que OSCA1.1 es necesario para la función promotora de la enfermedad de XopD al suprimir el marchitamiento y la necrosis temprana en hojas infectadas y que puede ser necesario un aumento de la expresión de OSCA1.1 dependiente de XopD para una susceptibilidad óptima del huésped. El estudio anterior sugirió que OSCA1.1 puede actuar aguas arriba de la señalización de ABA, ya que el cierre estomático inducido por la aplicación exógena de ABA no se vio afectado en el mutante osca1-121. Sin embargo, se desconocen los componentes posteriores activados por OSCA1.1 en respuesta al estrés osmótico. Curiosamente, trabajos recientes sobre vías de señalización activadas por estrés osmótico sugieren que, si bien la elevación de Ca2+ no es esencial en el cierre estomático mediado por ABA, el aumento de Ca2+ facilita cierres de nivel más rápidos y estables33. Por lo tanto, una posible explicación es que un aumento de la transcripción de OSCA1.1 dependiente de XopD podría regular positivamente las actividades del canal de Ca2+ OSCA1.1 en las células huésped efectoras-receptoras, lo que resulta en niveles elevados de Ca2+ que aceleran y estabilizan el cierre estomático mediado por ABA (Fig. 5). ).

Curiosamente, estudios previos sobre los canales permeables a Ca2+ de Arabidopsis OSCA1.3 y OSCA1.7 demostraron su relevancia funcional en la regulación del cierre estomático para prevenir la entrada de P. syringae34. En particular, OSCA1.1 es un canal mecanosensible activado por hiperosmolalidad que se activa en respuesta al estrés osmótico para prevenir la pérdida de agua21, y la deshidratación de las hojas inducida por infección XccΔxopD* proporciona potencialmente los componentes de activación basados ​​en hiperosmolalidad para el aumento dependiente de XopD del canal OSCA1.1 Ca2+. actividad. Por el contrario, la actividad del canal permeable al Ca2+ de OSCA1.3 y OSCA1.7 se activa mediante fosforilación por el receptor inmune quinasa BIK1 tras la percepción del patógeno34. Esto sugiere que mecanismos reguladores adicionales, como las modificaciones postraduccionales, contribuyen a la regulación de las actividades de los canales de Ca2+ de las plantas en respuesta a distintos estímulos. Además, a diferencia de P. syringae, que es un patógeno mesófilo que ingresa a la planta a través de los estomas1, Xcc es un patógeno vascular que ingresa a la planta a través de hidatodos2. Por lo tanto, el cierre estomático mediado por diferentes canales permeables a Ca2+ podría actuar como centros diferenciales de inmunidad contra patógenos del mesófilo versus la promoción de enfermedades de patógenos vasculares.

Al enfatizar el poder de los estudios de todo el genoma del transcriptoma y el epigenoma en células efectoras-receptoras, descubrimos 924 genes regulados por XopD involucrados en diversos mecanismos, por ejemplo, silenciamiento de genes, regulación negativa de la expresión génica, desarrollo de gametofitos y aminoacilación de ARNt (Fig. 2b y Tabla complementaria 2), algunos de los cuales se correlacionan con cambios de metilación del ADN en sus promotores, por ejemplo, SUVH9 (Fig. 2c). Aunque en este estudio nos centramos en investigar la función de XopD en la regulación transcripcional de la señalización osmótica, sería interesante para estudios futuros caracterizar cómo otros mecanismos previamente desconocidos pueden contribuir colectivamente a las funciones in planta de XopD.

De acuerdo con trabajos anteriores10, no observamos ninguna diferencia notable en la transcripción de genes sensibles a GA dependientes de DELLA entre nuc-XopD y nuc+XopD, a pesar de que XopD interactúa físicamente con las proteínas DELLA, que comúnmente se sabe que son reguladores negativos de Señalización GA10. Vale la pena señalar que, en algunos contextos, las proteínas DELLA actúan como reguladores positivos de la señalización de ABA35. Por ejemplo, DELLA recluta directamente TF ABI3 y ABI5 para activar genes que responden a ABA durante la germinación de semillas35, mientras que la sumoilación de ABI5 atenúa su capacidad de unión al ADN36. Descubrimos que un gen que responde a ABA dependiente de ABI5, RD29A36, tenía una mayor expresión en nuc + XopD en nuestro análisis del transcriptoma (Fig. 4a, b), lo que hace posible que XopD interactúe con DELLA para manipular funciones de los TF que interactúan con DELLA a través de su actividad proteasa SUMO para activar las respuestas ABA (Fig. 5). En este contexto, se ha demostrado que un homólogo de XopD, XopDXe de la cepa 85-10 (Xe85-10) de X. euvesicatoria, deSUMOila y desestabiliza el factor de transcripción SlERF4 sensible al etileno del tomate para suprimir las respuestas de defensa mediadas por etileno37. El análisis de la estructura de la proteína muestra que XopDXe contiene una secuencia de extensión N-terminal y un supuesto dominio hélice-bucle-hélice de unión al ADN que están ausentes en XopD9 (Datos ampliados, figura 1). Además, XopD no puede complementar el mutante Xe85-10ΔxopDXe9, lo que sugiere funciones distintas de XopD y XopDXe.

Para terminar, hemos establecido un nuevo concepto para recuperar núcleos de células huésped efectoras-receptoras de tejidos foliares infectados y hemos demostrado que el sistema eINTACT nos permite descubrir cambios transcripcionales y epigenéticos del huésped dependientes de efectores que eran indetectables cuando se eliminaban tejidos foliares infectados en masa. utilizados como material de estudio. Además, eINTACT es especialmente adecuado para revelar en planta funciones de efectores que están sujetos a pautas dosis-dependientes, espacio-temporales y específicas del tipo de célula. Actualmente, la secuencia de ARN unicelular se utiliza cada vez más para medir los niveles de expresión génica en tipos de células individuales en plantas38. Sin embargo, la infección bacteriana induce cambios en la turgencia celular, la integridad de la pared celular y el tamaño de las células que inevitablemente afectan los procesos de aislamiento y clasificación de las células, restringiendo el uso de secuencias de ARN unicelulares en estudios de patología vegetal38. Por lo tanto, eINTACT se presenta como un método único, conveniente y de bajo costo para aislar núcleos de alta calidad en células huésped bacterianas dirigidas a efectores para análisis transcriptómicos y epigenómicos posteriores sin equipos costosos y especializados. En este estudio, utilizamos la administración de AvrBs3 mediada por Xcc para activar el indicador eINTACT en células de Arabidopsis para estudiar el efector Xcc XopD. También es factible transferir AvrBs3 a otras especies bacterianas, por ejemplo, el patógeno modelo ampliamente utilizado P. syringae. . Por lo tanto, anticipamos que el sistema eINTACT recientemente establecido proporcionará una base para dilucidar con precisión la función de los efectores de numerosas bacterias vegetales gramnegativas en contextos de infección nativa.

Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en este trabajo se enumeran en la Tabla complementaria 6. Los plásmidos y las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se resumen en la Tabla complementaria 7. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger.

La accesión Col-0 de Arabidopsis thaliana se utilizó como planta de tipo silvestre en este trabajo. Las semillas homocigotas de la línea transgénica ProXVE:XopD no. 38 que expresan XopD bajo el control de un promotor inducible por β-estradiol, el mutante osca1-1, las líneas ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP y Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 se establecieron en estudios previos11,21.

Antes de la siembra, las semillas se estratificaron en agar 0,1% a 4 °C durante tres días. Para generar la línea transgénica y para el tratamiento con β-estradiol, las plantas se cultivaron en suelo o placas de agar que contenían 1/2 medio Murashige y Skoog (MS), 0,8% de agar y los antibióticos apropiados en cámaras de crecimiento en condiciones de día largo (16 h de luz y 8 h de oscuridad) a 22 °C con humedad relativa 50%.

Para los ensayos de infección, las plantas se cultivaron en el suelo en cámaras de crecimiento en condiciones de días cortos (8 h de luz y 16 h de oscuridad) a 22 °C con una humedad relativa del 50 % durante cinco semanas. Dos días antes de las infecciones, las plantas se transfirieron a una cámara de crecimiento de día corto a 25 °C con una humedad relativa del 60 %, que es el límite superior de temperatura y humedad para un crecimiento óptimo de Arabidopsis39. La humedad relativa más cálida y más alta es favorable para la infección por Xcc y promueve el desarrollo más temprano de los síntomas en dos días. Las plantas infectadas se mantuvieron en la cámara de día corto a 25 °C con una humedad relativa del 60% o 95%. La condición de luz se construyó mediante una mezcla de luces fluorescentes Cool White y Gro-Lux Wide Spectrum, con una tasa de fluencia de 125 a 175 μmol m-2 s-1.

Para la preparación de la construcción ProBs3:RedNTF:tNOS (denominada pYY1704), se clonó un plásmido de entrada compatible con Gateway que porta la secuencia promotora de 344 pares de bases (pb) del gen18 Bs3 de pimienta en un vector de destino basado en pGREEN-IIS que contiene el Casete de recombinación attR1-attR2 Gateway (pFK-386). Se utilizó la mezcla de enzimas Gateway LR clonasa II (Invitrogen) para las reacciones Gateway. Posteriormente, se clonó un terminador de nopalina sintasa después del casete attR1-attR2 mediante clonación del extremo adhesivo usando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Finalmente, el fragmento de ADN de la proteína NTF del plásmido pYY120416 se colocó entre el promotor Bs3 y el terminador de la nopalina sintasa mediante clonación del extremo adhesivo utilizando la enzima de restricción EcoRI.

La construcción Pro35S:RedNTF:rbcs (denominada pYY1705) se generó mediante la recombinación Gateway del plásmido de entrada pYY120416 y un vector de destino basado en pGREEN-IIS que alberga el promotor 35S en la parte frontal del casete de recombinación Gateway attR1-attR2 (pFK-209). .

Para generar la línea indicadora eINTACT y las líneas indicadoras Pro35S-INTACT, pYY1704 y pYY1705 se transformaron en líneas homocigotas ProUBQ10:BirA16, utilizando la cepa ASE de Agrobacterium tumefaciens y el método de inmersión floral40. Se seleccionaron líneas homocigotas en placas de agar 1/2 MS que contenían 50 μg ml-1 de kanamicina.

Los dos elementos de unión efectores (EBE) de TAL de 18 pb, precedidos por timina (T), se identificaron aproximadamente 50 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de OSCA1.1. Sus secuencias de nucleótidos son: EBE#1, TCTTGTGTGTTTCTCGCGT; EBE#2, TACTTCATTCATCACTGCT. Para clonar los dTALE dirigidos a estos EBE, se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN que codifica la región N-terminal (290 aa) y C-terminal de AvrBs3 (281 aa), flanqueado por sitios de enzima de restricción BsaI, y posteriormente se clonó en un pENTR CACC-AAGG. vector plasmídico41, que produce pENTR TALE N/C. Posteriormente, el fragmento TALE-BamHI en el vector pSKX1-ArtTAL42 se reemplazó por el fragmento AvrBs3 N/C de pENTR TALE N/C haciendo uso de la enzima de restricción BamHI, produciendo pSKX1-TALE N/C. Los residuos variables repetidos de dTALE dirigidos a los dos EBE, dTALE#1, HD-NG-NG-NH-NG-NH-NG-NH-NG-NG-NG-HD-NG-HD-NH-HD-NH-NG ; dTALE#2, NI-HD-NG-NG-HD-NI-NG-NG-HD-NI-NG-HD-NI-HD-NG-NH-HD-NG, fueron creados mediante ensamblaje modular y finalmente clonados en pSKX1 -TALE N/C haciendo uso de la enzima de restricción BpiI43, produciendo pSKX1-dTALE#1 y pSKX1-dTALE#2.

Para crear la cepa mutante 8004∆avrAC∆xopAM∆xopD (Xcc∆xopD*), se introdujo la eliminación de xopD en el mutante de doble eliminación Xcc 8004∆avrAC∆xopAM (Xcc*) utilizando el sistema SacB con un vector suicida pK18 modificado19 y se verificó mediante PCR. Para crear Xcc*AvrBs3 (8004∆avrAC∆xopAM pDS300F) y Xcc∆xopD*AvrBs3 (8004∆avrAC∆xopAM∆xopD pDS300F), se conjugó un plásmido basado en pDSK que expresaba AvrBs3 (pDS300F)18 en los mutantes doble y triple, respectivamente, por apareamiento triparental19. Xcc*vec1 y Xcc*vec2 se prepararon transformando Xcc* con un plásmido pDSK y pSKX1 vacío, mediante electroporación. Para generar cepas bacterianas que liberan dTALE, se transformaron Xcc* o Xcc∆xopD* con pSKX1-dTALE#1 y pSKX1-dTALE#2 mediante electroporación, produciendo Xcc*dTALE#1, Xcc*dTALE#2, Xcc∆xopD*dTALE #1, Xcc∆xopD*dCUENTO#2. Todas las cepas Xcc se cultivaron en placas de agar glicerol de levadura nutritiva a 28 °C y la selección de antibióticos se llevó a cabo utilizando las siguientes concentraciones (en µg ml-1): rifampicina, 50; espectinomicina, 40; gentamicina, 15.

Cuando se utilizó el método de inoculación por herida, se inocularon hojas completamente expandidas de plantas de cinco semanas de edad con inóculo bacteriano (108 UFC ml-1, OD: 0,1 en MgCl2 1 mM), perforando la vena central de la hoja tres veces con una aguja. que había sido sumergido en inóculo bacteriano19. Se utilizaron plantas inoculadas con MgCl2 1 mM como control inoculado de forma simulada. Cuando se utilizó el método de infiltración, los lados abaxiales de las hojas se infiltraron con inóculo bacteriano utilizando una jeringa de extremo romo.

Después de la inoculación, las bandejas de plantas se cubrieron con cubiertas de plástico transparente y se sellaron para mantener casi el 100% de humedad relativa durante 24 h. A un DPI se retiraron las cubiertas para mantener las plantas infectadas con una humedad relativa del 60%. Para mantener las plantas infectadas con una humedad relativa alta (95%) en algunos experimentos, las cubiertas se abrieron ligeramente. Se utilizó un medidor de humedad móvil para controlar la humedad en las bandejas.

Se utilizó un sistema de imágenes LEICA DMI3000 B para todas las imágenes de este trabajo, utilizando filtros de campo brillante, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), mCherry y GFP.

Se recolectaron y procesaron tres conjuntos de muestras de hojas de forma independiente entre sí. Para cada conjunto, se inocularon aproximadamente 650 hojas de plantas informadoras eINTACT con Xcc*AvrBs3 o Xcc ∆xopD*AvrBs3, utilizando el método de herida. Las hojas inoculadas se recogieron a cinco DPI y se congelaron inmediatamente en tubos Falcon de 50 ml suspendidos en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80 ° C antes de la purificación INTACTA. Los experimentos INTACT se realizaron como se describió anteriormente16,17. La pureza y el rendimiento de los núcleos se evaluaron mediante microscopía. De cada muestra de hoja, se obtuvieron aproximadamente 2,5 × 105 núcleos y se dividieron en 1 × 105 para preparar una biblioteca de RNA-seq, 1 × 105 para el análisis de qPCR Stem-loop de miRNA y 5 × 104 para preparar una biblioteca enzimática de secuenciación de metilo. . Las muestras nucleares se almacenaron a -80 °C antes de realizar más experimentos.

Para validar el sistema eINTACT, se prepararon núcleos totales de hojas de la línea indicadora eINTACT infectadas con Xcc*vec1 o Xcc*AvrBs3 siguiendo el protocolo de preparación para los núcleos de entrada antes de la purificación INTACT16,17. Los núcleos efectores-receptores se purificaron a partir de hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 mediante INTACT. Como control se utilizaron los núcleos totales de las hojas de la línea informadora Pro35S-INTACT. Las muestras de proteínas nucleares se prepararon mezclando núcleos totales y aproximadamente 10 000 núcleos purificados con INTACT con tampón SDS 1X, se desnaturalizaron hirviendo a 95 °C durante 5 minutos y se analizaron mediante transferencia Western. La proteína NTF biotinilada (∼42 kDa) se detectó usando estreptavidina fosfatasa alcalina (Promega), y las señales se desarrollaron mediante una reacción de color usando una solución NBT-BCIP (Roche). La cantidad de proteína H3 (~15 kDa) se midió como control interno del número de núcleos en cada muestra, utilizando un anticuerpo anti-H3 (Millipore, número de catálogo 17-10254) a una dilución de 1:1000 y un anticuerpo anti-H3. anticuerpo secundario de conejo (IRdye680/LI-COR, n.º de catálogo 925-68073) a una dilución de 1:10 000. La señal del fluoróforo conjugado se visualizó con un escáner Amersham Typhoon (GE Healthcare Life Sciences) usando un filtro BPFR 700 a 680 nm.

Para examinar la sobreexpresión de OSCA1.1-GFP inducida por dTALEs administrados por bacterias, las hojas infiltradas con bacterias de la línea transgénica ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP se recolectaron a un DPI y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Las muestras de hojas se molieron y se mezclaron con tampón SDS 2X, se desnaturalizaron hirviendo a 95 °C durante 5 minutos y se analizaron mediante transferencia Western. Se utilizó un anticuerpo anti-GFP monoclonal de ratón conjugado con HRP (Santa Cruz Biotechnology, n.º de catálogo sc-9996 HRP) en una dilución de 1:2000 para detectar OSCA1.1-GFP. Las señales fueron reveladas por Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) y detectadas en un Amersham Imager 600. Después de la detección de señales de GFP, la membrana de transferencia Western se tiñó en Ponceau S y se lavó con agua para visualizar todas las bandas de proteínas en el muestras. Las bandas de proteínas teñidas de las subunidades de Rubisco se utilizaron como controles de carga.

Los tamaños de las proteínas detectadas se juzgaron de acuerdo con una escalera de proteínas preteñida PageRuler (Thermo Fisher Scientific).

RNA-seq se realizó en tres réplicas biológicas independientes para nuc+XopD y nuc-XopD. Para cada muestra, se extrajeron aproximadamente 500 pg de ARN nuclear de aproximadamente 105 núcleos utilizando el micro kit RNeasy Plus (Qiagen) y se trataron adicionalmente con DNasa I (0,05 U por μl, Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 37 °C para eliminar cualquier contaminar el ADN genómico. El ADNc de doble cadena (ds) se sintetizó a partir de aproximadamente 500 pg de ARN mediante dos rondas de amplificación lineal utilizando el kit SMARTer Ultra Low Input RNA para Illumina Sequencing-HV (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración y el rendimiento del ADNc amplificado se determinaron utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit dsDNA (Invitrogen). Las bibliotecas de RNA-seq se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de bajo ingreso (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y cantidad de las bibliotecas de RNA-seq se examinaron utilizando el kit de ADN de alta sensibilidad (Agilent). La secuenciación se realizó en el sistema NovaSeq 6000 (Novogene, Reino Unido). Para cada muestra se recopilaron de 33,2 a 40,9 millones de lecturas de extremos emparejados de 2 × 150 pb que pasaron el filtro de control de calidad de Illumina (Tabla complementaria 8).

La eliminación del adaptador y el recorte de calidad de las lecturas se realizaron utilizando AdapterRemoval v.2.1.7 (parámetros: -min calidad 20, -min longitud 50)44. Las lecturas de RNA-seq se asignaron al transcriptoma de referencia de Arabidopsis TAIR10 v.47, con regiones de ARN ribosomal (2:3471-9557; 3:14197350-14203988) enmascaradas, usando TopHat 2.0.13 (alineaciones no mezcladas; hasta 20 secundarias). alineaciones; no hay nuevos cruces)45. Los recuentos de lectura que cubren las transcripciones se calcularon utilizando el programa featureCounts en R46 y se sometieron a un análisis de expresión génica diferencial en DESeq2 (v.1.32.0) en R (v.4.1.0) (parámetros predeterminados; condiciones de significancia: expresión de bases > 5, tasa de descubrimiento falso (FDR) valor P ajustado < 0,05, |log2FC| > 1)47.

La herramienta en línea AmiGO 248 (prueba de sobrerrepresentación PANTHER publicada en 20210224; base de datos de ontología GO publicada el 2 de julio de 2021) se utilizó para identificar términos GO en procesos biológicos que están sobre o subrepresentados en DEG dependientes de XopD. Se realizaron pruebas binomiales y se consideró significativo el valor de P ajustado por FDR < 0,05. El gráfico de red de concepto genético se realizó mediante la función cnetplot en el paquete clusterProfiler (clusterProfiler v.3.18.1)49 en R (v.4.0.5).

Se extrajeron aproximadamente 5 ng de ADN genómico de aproximadamente 1,5 × 105 núcleos de cada tipo de muestra, utilizando el kit DNeasy Plant Pro (QIAGEN), y se trataron con ARNasa A (Thermo Scientific) para eliminar cualquier ARN contaminante. Posteriormente, se cortaron aproximadamente 5 ng de ADN (incluidos 0,02 ng de ADN lambda no metilado y 0,001 ng de ADN de pUC19 metilado >96 % añadido) en fragmentos de 100 a 500 pb utilizando un ultrasonido enfocado (sistema Covaris E220), en microtubos a una ajuste de 175 potencia incidente máxima, 10 cc, 200 cpb durante 40 s. Se prepararon bibliotecas de secuenciación enzimática de metilo (EM-seq) a partir de ADN cortado utilizando el kit NEBNext Enzymatic Mmethyl-seq siguiendo las instrucciones del fabricante (New England BioLabs). Debido a que la cantidad de material de ADN inicial es inferior a 10 ng, la cantidad mínima de material inicial recomendada por el fabricante, agregamos dos ciclos de PCR en el paso final de la amplificación por PCR de las bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas se secuenciaron en el sistema NovaSeq 6000 (Novogene) para recopilar lecturas de extremos emparejados de 2 × 150 pb que pasaron el filtro de control de calidad de Illumina (Tabla complementaria 8).

Las lecturas de EM-seq fueron recortadas por adaptador y calidad mediante trim_galore v.0.6.450, antes de mapearlas al genoma de referencia de Arabidopsis (TAIR10 v.47) y secuencias de control (ADN lambda y pUC19), usando Bowtie v.2.2.3 ( puntuación-min L, 0, −0,6)51. La deduplicación y la inferencia de metilación se realizaron en Bismark v.0.22.352, ignorando 3 pb adicionales de extremos de lectura según el sesgo M. Se probaron los recuentos finales de citosina con una cobertura mínima de cuatro lecturas para detectar una metilación falsa, por contexto, ajustando un modelo binomial basado en el control negativo (ADN lambda no metilado). Se aplicó el procedimiento de Benjamini-Hochberg con un umbral de FDR del 5%.

Dado el número limitado de núcleos dirigidos a efectores disponibles en eINTACT, combinamos aproximadamente 5 × 104 núcleos de cada una de las tres réplicas biológicas (recolección de muestras y purificación de núcleos efectores-receptores) para hacer una muestra agrupada de cada tipo de núcleos. Por lo tanto, para identificar regiones metiladas diferencialmente (DMR) para cada contexto (CG, CHG, CHH), utilizamos DSS-single (v.2.38) en R (v.4.0.3), un método estadístico que utiliza información de sitios CG vecinos. para estimar la variación biológica en una sola muestra, que se ha demostrado que tiene mayor sensibilidad y precisión para producir los resultados biológicamente más significativos incluso sin réplicas53. Para las llamadas DMR, el umbral del valor P por residuo se estableció en 0,05. Además, la lista de DMR obtenida se filtró en función de límites estrictos de longitud >100 pb, diferencia media de metilación >0,15, estadística de prueba areaStat >10. Se utilizó un navegador de epigenomas WashU instalado localmente para visualizar la metilación del ADN con una resolución de base única54.

Las características genómicas superpuestas de DMR se extrajeron utilizando el genoma de referencia de Arabidopsis TAIR10 v.47 y los archivos de anotación Araport11 para las ubicaciones de transposones y pseudogenes. Para asociar los DMR con genes codificadores de proteínas, se extrajeron los DMR ubicados dentro de regiones proximales de 3 kb, 3 kb aguas arriba del TSS y 3 kb aguas abajo del sitio de terminación de la transcripción. Las posiciones relativas a los genes se calcularon desde la mitad de DMR hasta los extremos del gen más cercano (TSS o sitio de terminación de la transcripción).

Para verificar los cambios de expresión de RD29A en nuc+XopD versus nuc-XopD mediante RT-qPCR, se utilizaron aproximadamente 100 pg de ADNc ds amplificado preparado a partir de muestras de ARN nuclear (secuenciación de ARN) en reacciones de qPCR. Para examinar la expresión genética relativa en muestras de hojas, se extrajo ARN de una o dos hojas de cada tipo de muestra utilizando el kit RNeasy Plant (Qiagen) y se trató con DNasa I (Thermo Fisher Scientific) para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) y el cebador oligo-dT. La reacción de PCR se realizó con cebadores específicos de genes y HS Taq Master Mix (Biozyme).

Las muestras de ADNc se utilizaron como plantillas para reacciones de qPCR, utilizando PowerUP SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) y cebadores específicos de genes, en una máquina de PCR en tiempo real CFX384 Touch (Bio-Rad). Los valores del umbral del ciclo de qPCR (Ct) de cada gen examinado se normalizaron a los valores promedio de Ct del gen de mantenimiento TUB2, y la expresión genética relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt. Debido a que las señales de amplificación de las muestras de XopD en plantas transgénicas ProXVE:XopD tratadas con DMSO no cruzaron el umbral de detección, el valor de Ct se estableció en 40, el número asignado de ciclos utilizados en el programa de PCR, para poder estimar las diferencias de manera conservadora. en expresión.

El análisis qPCR se realizó utilizando dos o tres réplicas biológicas independientes de cada tipo de muestra que se cultivaron al mismo tiempo pero se cosecharon y procesaron de forma independiente entre sí con tres réplicas técnicas por muestra. Las diferencias estadísticas se calcularon mediante análisis de prueba t no pareada bilateral.

Las muestras nuc+XopD y nuc-XopD se utilizaron con núcleos totales de plantas inoculadas simuladamente como control. Los niveles de expresión de miR159a en estas muestras se midieron mediante qPCR de tallo-loop siguiendo el protocolo de trabajos anteriores31 con algunas modificaciones. El ARN total se preparó a partir de aproximadamente 105 núcleos de cada muestra de núcleo, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante, y posteriormente se trató con ADNasa I para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. La síntesis de ADNc se realizó utilizando la transcriptasa inversa PromeScript (Takara) con una mezcla de cebadores RT de bucle de tallo para cada miARN y un cebador oligo-dT para los genes de mantenimiento ACTIN2/8. Antes de la qPCR, el ADNc de cada una de las réplicas biológicas se preamplificó durante 12 ciclos utilizando Phusion Polymerase (Thermo Scientific) y los cebadores específicos de miRNA. La condición de PCR fue un ciclo a 95 °C durante 5 min y 12 ciclos de 96 °C durante 10 s seguido de 60 °C durante 30 s. Los productos preamplificados se precipitaron con la adición de glucógeno (Thermo Scientific) y se disolvieron en 10 µl de agua DEPC. Luego, la muestra completa se usó como plantilla para la reacción qPCR realizada en un volumen de reacción de 20 µl en un aparato de conexión Bio-Rad CFX usando SYBR Green Master Mix (Bio-Rad) durante 40 ciclos. Los valores de Ct de cada miARN se normalizaron a los valores promedio de Ct de ACTIN2/8, y el cambio en veces se calculó mediante el método 2-ΔΔCt. El análisis qPCR se realizó para tres réplicas biológicas independientes de cada tipo de muestra con dos réplicas técnicas por muestra. Las diferencias estadísticas se calcularon mediante análisis de prueba t no apareado bilateral y se corrigieron con FDR para comparaciones de pares múltiples.

Las plantas se inocularon con cepas bacterianas relativas mediante el método de herida, como se describe en la sección Ensayo de infección. Todos los días, a partir de un DPI, se roció ABA 20 μM (Duchefa) en NaOH 100 μM y Silwet L-77 al 0,02% sobre hojas infectadas con Xcc∆xopD*. Como control simulado se utilizaron hojas rociadas con NaOH 100 μM y Silwet L-77 al 0,02%.

Las plántulas ProXVE:XopD (línea transgénica nº 38)11 se germinaron y se cultivaron en placas de agar 1/2 MS que contenían 12,5 µg ml-1 de higromicina, en cámaras de crecimiento en condiciones de día largo. Las plántulas de dos semanas de edad se transfirieron a medio líquido 1/2 MS que contenía β-estradiol 20 μM (disuelto en DMSO) o solo DMSO, y se incubaron en un agitador de 60 rpm colocado en la cámara de crecimiento de día largo. Después de una incubación de 48 h, las plántulas se recolectaron y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, antes de analizar la expresión de los genes de interés mediante RT-qPCR.

Las hojas inoculadas con Xcc*AvrBs3 y XccΔxopD*AvrBs3 de la línea informadora eINTACT se recolectaron a cinco DPI. Los tejidos de las hojas se pesaron (50 mg ± 10%) y se transfirieron a tubos separados con cierre de seguridad de 2 ml que contenían una bola de acero de 5 mm. Los tubos de muestra se congelaron recientemente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Para extraer ABA endógeno, el tejido de la hoja se trituró utilizando un molino Retch (2 × 15 s) con enfriamiento intermitente en nitrógeno líquido. Todos los disolventes (grado LC-MS) utilizados en los siguientes pasos se enfriaron previamente a 8 °C. Se agregaron a la muestra molida doscientos µl de MeOH al 80% que contenía D6-ABA 50 nM (estándar isotópico, OlChemIm). La mezcla se incubó durante 5 min en un baño ultrasónico a 16 °C y posteriormente se centrifugó a 4 °C, 18620 RCF durante 5 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo previamente enfriado. El sedimento restante se volvió a extraer con 600 µl de H2O y ácido fórmico al 0,1% utilizando las mismas condiciones que en el paso anterior. Las fracciones de sobrenadante combinadas se midieron directamente mediante LC-MS dirigida. El análisis LC-MS se realizó como se describió anteriormente55 excepto por el uso de una columna Luna Omega Polar C18 (3 μm; 100 Å; 150 × 0,5 mm; Phenomenex), una columna trampa Luna C18(2) (5 μm; 100 Å; 20 × 0,5 mm; Phenomenex) con una temperatura de columna aumentada de 55 °C y un caudal de 28 µl min-1 para la columna principal. El contenido de ABA en una muestra se normalizó frente a los valores de D6-ABA.

El análisis LC-MS se realizó para cuatro réplicas biológicas independientes de cada tipo de muestra que crecieron e infectaron en diferentes momentos, con tres réplicas técnicas por muestra. Las diferencias estadísticas se calcularon mediante análisis de prueba t no pareada bilateral.

Ocho hojas infectadas con Xcc* o Xcc∆xopD*, de cuatro plantas diferentes mantenidas con una humedad relativa del 95 %, se cortaron a siete DPI y se colocaron en condiciones ambientales (aproximadamente 25 °C con una humedad relativa del 35 %). Las hojas se pesaron en los tiempos 0, 20, 40, 60, 120 y 180 min. La tasa de pérdida de agua se calculó como porcentaje del peso fresco inicial. Se calcularon los valores medios para ocho hojas. El experimento se repitió dos veces con resultados similares.

Se recolectaron hojas enteras o áreas foliares sintomáticas infectadas con una cepa Xcc determinada a siete DPI y se colocaron entre láminas de plástico transparente. Los tamaños de las hojas (cm2) se determinaron en imágenes escaneadas utilizando el software ImageJ (v.2.0.0-rc-69/1.52p). Luego, cada muestra de hoja se homogeneizó en 400 µl de agua estéril en tubos con cierre de seguridad que contenían una bola de cerámica de 5 mm utilizando el TissueLyser II (QIAGEN). Se realizaron diluciones en serie de los homogeneizados y se colocó tres veces una gota de 4 µl de cada dilución en placas de glicerol de levadura nutritiva suplementadas con antibióticos apropiados. Las placas se incubaron a 28 °C durante 48 h y se contaron las colonias en puntos que contenían de 3 a 30 colonias. La media de poblaciones bacterianas por cm2 de tejido foliar se calculó con tres repeticiones técnicas por muestra. Las diferencias estadísticas (P <0,05) entre dos tipos de muestras se calcularon mediante un análisis de prueba t no apareado bilateral, y entre todos (>2) tipos de muestras se analizaron mediante ANOVA seguido de la diferencia post hoc honestamente significativa de Tukey. Los experimentos se realizaron al menos dos veces con resultados similares.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq y EM-seq se han depositado en la base de datos ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress) con números de acceso E-MTAB-10280 y E-MTAB-10281. El genoma de referencia de Arabidopsis (TAIR10 v.47) y la anotación genética están disponibles públicamente en http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-47/. La anotación Araport11 para transposones y pseudogenes está disponible públicamente en https://datacommons.cyverse.org/browse/iplant/home/araport/public_data/Araport11_Release_201606/annotation. Los autores declaran que todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Z.-M. Pei y F. Yuan por contribuir con las semillas de Arabidopsis osca1-1, ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP y Pro35S:OSCA1.1/osca1-1; D. Weigel por contribuir con los plásmidos pFK-386 y pFK-209; J.-Y. Yang por contribuir con las semillas de ProXVE:XopD Arabidopsis; y AG Andrade-Galan por su asistencia técnica. Nuestro estudio se beneficia de la infraestructura de la ZMBP y del Centro de Redes y Supercomputación de Poznań; el LIPME como parte del proyecto del Laboratorio de Excelencia francés (TULIP ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02) y la acción COST CA16107 EuroXanth to LDN; y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 1101 proyecto D08 y LA 1338/9-1) a TL. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Estrategia Institucional de la Universidad de Tübingen (DFG, ZUK 63) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, No. 427105396) a AA

Departamento de Genética General, Centro de Biología Molecular Vegetal (ZMBP), Universidad Eberhard-Karls de Tübingen, Tübingen, Alemania

Yuan You, Robert Morbitzer, Danalyn R. Holmes y Thomas Lahaye

Departamento de Biometría y Bioinformática, Instituto de Genética Vegetal, Academia Polaca de Ciencias, Poznań, Polonia

Grzegorz Koczyk, Maria Nuc y Paweł Krajewski

Instalaciones centrales: análisis, ZMBP, Universidad Eberhard-Karls de Tübingen, Tübingen, Alemania

Edda von Roepenack-Lahaye

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Laboratorio Clave de Patología Vegetal de Hubei, Laboratorio Hongshan de Hubei, Facultad de Ciencia y Tecnología Vegetal, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, República Popular de China

Shiji Hou

Instituto de Agrobiotecnología del Litoral (CONICET-UNL), Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina

Axel Giudicatti y Paul A. Manavella

Laboratorio de Interacciones Planta-Microbio-Medio Ambiente (LIPME), Universidad de Toulouse, INRAE, CNRS, Castanet-Tolosan, Francia

Carine Gris y Laurent D. Noël

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YY adquirió financiación, supervisó el trabajo y realizó la mayoría de los experimentos; GK analizó los datos de EM-seq; MN y PK analizaron datos de RNA-seq; RM preparó dTALE; DRH ayudó con la clonación y la inmunotransferencia; EvR-L. contenido de ABA medido por LC-MS; SH realizó análisis GO; AG y PAM realizaron qPCR de vástago-asa; Cepas bacterianas preparadas por CG, RM, YY, CG y LDN; TL tuvo la idea inicial de un sistema INTACTO inducible por TALE; y YY probaron el concepto y desarrollaron el sistema Arabidopsis-Xcc eINTACT. YY analizó los resultados generales y escribió el manuscrito con aportaciones de GK, DRH, LDN, PK y TL.

Correspondencia a Yuan You.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Adam Bogdanove y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

XopD de Xanthomonas campestris pv. La cepa campestris 8004 (XopD en nuestro estudio) contiene tres motivos de represión anfifílica (EAR) asociados al factor de unión al elemento sensible al etileno específicos de la planta (rojo) en el extremo N, seguidos de un dominio de cisteína proteasa C-terminal (púrpura), y una secuencia de localización nuclear de planta (NLS) en el extremo C. XopDXe de X. euvesicatoria cepa 85-10 (Xe85-10) contiene una secuencia de extensión N-terminal (gris) y un supuesto dominio hélice-bucle-hélice de unión al ADN (DBD, verde) que están ausentes en XopD. XopDXe tiene sólo dos motivos EAR.

( a ) Enriquecimiento de la proteína NTF en núcleos purificados con eINTACT. Detección de proteínas NTF y H3 mediante transferencia Western de los extractos de proteínas nucleares totales de hojas infectadas con Xcc*vec1 (Xcc*vec1, carril B), los núcleos totales (Xcc*AvrBs3, carril C) y los núcleos purificados con eINTACT (nuceINTACT, carril D) de hojas infectadas con Xcc*AvrBs3. La membrana transferida se dividió en dos entre 15 kDa y 25 kDa, según las marcas de tamaño en la escalera de proteínas (carril A). La parte superior (25–180 kDa) se usó para detectar la proteína NTF biotinilada, utilizando estreptavidina fosfatasa alcalina. La parte inferior (10–15 kDa) se usó para detectar la proteína H3 utilizando un anticuerpo anti-H3. La abundancia de proteína H3 sirve como control interno del número de núcleos en cada muestra. Se utilizó como control positivo una muestra de núcleos totales de hojas inoculadas simuladamente de una línea indicadora Pro35S-INTACT, que sobreexpresa NTF biotinilado bajo el control del promotor 35S (Pro35S-INTACT, carril E). El experimento se repitió dos veces de forma independiente con resultados similares. (b) Una hoja representativa de la línea informadora eINTACT inoculada con Xcc*AvrBs3 y una hoja Col-0 de tipo salvaje representativa inoculada con Xcc*vec1 a siete DPI. (c) Un diagrama de caja que representa la densidad de población bacteriana en n = 12 hojas de la línea informadora eINTACT inoculadas con Xcc*AvrBs3 y n = 12 hojas de Col-0 de tipo salvaje inoculadas con Xcc*vec1 a siete DPI. Las líneas horizontales desde la parte superior muestran valores máximos, cuartil superior, mediana, cuartil inferior y mínimos: las marcas cruzadas muestran los valores medios; y los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales. Las n = 12 hojas se recolectaron de 4 a 6 plantas diferentes. La significación estadística se determina mediante la prueba t no pareada bilateral (línea informadora eINTACT versus Col-0, P = 0,525). ns, no significativo (P > 0,05).

Datos fuente

(a) Mapas de calor que muestran los niveles de mC en cada contexto y la densidad de genes y elementos transponibles (TE), dentro de contenedores de 100 kb en todo el genoma. Los niveles máximos de mC son 0,88 (mCG), 0,50 (mCHG), 0,17 (mCHH). ( b ) Niveles globales de metilación del ADN en nuc + XopD y nuc-XopD. (c) Números de cada tipo de regiones metiladas diferencialmente (DMR) en comparación de nuc+XopD versus nuc-XopD. Los DMR se clasifican por valores de AreaStat (10 a 100, estadística de prueba DSS) en mapas de calor. ( d ) Fracciones de DMR que se superponen con TE, genes codificadores de proteínas (PC), otros genes y sin características genómicas. Algunos DMR pertenecen a varias categorías. (e) Superposición entre regiones proximales de 3 kb de genes de PC y DMR. Otros se refieren a DMR que no se superponen con regiones genéticas proximales de 3 kb. TSS, sitio de inicio de la transcripción; TTS, sitio de terminación de la transcripción. Algunos DMR pertenecen a varias categorías.

(a – e) Los datos se presentan como valores medios +/− sd (barras de error) de n = 2 o 3 réplicas biológicas independientes. Los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales. La significación estadística se determina mediante la prueba t no apareada bilateral (hojas inoculadas Xcc∆xopD*AvrBs3 versus hojas inoculadas con Xcc*AvrBs3; NRPD1A, P = 0,829; DDM1, P = 0,560; HYL1, P = 0,212; DWA1, P = 0,348 ; OSCA1.1, P = 0,704). ns, no significativo (P > 0,05).

Datos fuente

Este sistema de índice es una modificación de Guy et al.19: 0, sin síntomas; 0,5 a 1,5, clorosis débil; 2 a 3, clorosis fuerte. En este sistema de índice no se consideró el grado de marchitez y necrosis.

( a ) Modelo genético de OSCA1.1 que muestra las posiciones de los pares de cebadores específicos de OSCA1.1 de tipo salvaje que contienen los ácidos nucleares mutados en osca1-1 en sus extremos 3 '. ( b ) RT-PCR semicuantitativa que detecta transcripciones de OSCA1.1 de tipo salvaje en plantas Col-0, osca1-1 y Pro35S: OSCA1.1 / osca1-1. El experimento se repitió dos veces de forma independiente con resultados similares. (c) Un diagrama de caja que representa las puntuaciones del índice de enfermedad (0, sin síntomas; 0,5 a 1,5, clorosis débil; 2 a 3, clorosis fuerte) de n = 30 de cada uno de Col-0, osca1-1 o Pro35S:OSCA1.1/osca1 -1 hojas infectadas con Xcc* de 8 plantas individuales a siete DPI. La significación estadística se determina mediante la prueba t no pareada bilateral (Col-0 versus osca1-1, P = 2,89e-5; Col-0 versus Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,038; osca1-1 versus Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,014). *P < 0,05, ***P < 0,001. (d) Un diagrama de caja que representa la densidad de población bacteriana en n = 12 de cada uno de Col-0, osca1-1 o Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 deja infectadas con Xcc* de 4 plantas diferentes a siete DPI. UFC, unidades formadoras de colonias. La significación estadística se determina mediante la prueba t no pareada bilateral (Col-0 versus osca1-1, P = 0,0009; Col-0 versus Pro35S:OSCA1.1/osca1-1, P = 0,011; osca1-1 versus Pro35S:OSCA1 .1/osca1-1, P = 0.0485). (c, d) En estos diagramas de caja, las líneas horizontales desde la parte superior muestran valores máximos, cuartil superior, mediana, cuartil inferior y mínimos; las marcas cruzadas muestran los valores medios; y los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales. (d) Hojas representativas de Xcc* inoculadas con Col-0, osca1-1 o Pro35S:OSCA1.1/osca1-1 a siete DPI.

Datos fuente

( a ) Descripción gráfica que muestra las posiciones de los EBE de dTALE#1 y dTALE#2 en el promotor del gen OSCA1.1 y las regiones predichas (80–150 pb aguas abajo de los EBE) de los TSS de las transcripciones activadas por dTALE. (b) Detección por inmunotransferencia de la proteína OSCA1.1-GFP en Mock (carril B), Xcc∆xopD*vec2 (vector, carril C), Xcc∆xopD*dTALE#1 (dTALE#1, carril D) y Xcc∆xopD *dTALE#2 (dTALE#2, carril E) hojas infiltradas de la línea transgénica ProOSCA1.1:OSCA1.1-GFP. (c) Tinción con Ponceau S de la membrana utilizada en (b). Las bandas de proteínas teñidas de la subunidad grande de Rubisco (Rubisco-ls) y la subunidad pequeña de Rubisco (Rubisco-ss) se indicaron como controles de carga. (b, c) Los experimentos se repitieron dos veces de forma independiente con resultados similares.

Los contenidos de ABA se cuantificaron mediante LC-MS para n = 4 réplicas biológicas, con 3 repeticiones técnicas por muestra. Los datos se presentan como valores medios +/− sd (barras de error) de n = 4 réplicas biológicas independientes. Los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales. La significación estadística se determina mediante la prueba t no pareada bilateral (hojas infectadas con Xcc*AvrBs3 versus hojas infectadas con XccΔxopD*AvrBs3, P = 0,438). ns, no significativo (P > 0,05).

Datos fuente

Las líneas horizontales desde la parte superior muestran valores máximos, cuartil superior, mediana, cuartil inferior y mínimos; las marcas cruzadas muestran los valores medios; y los círculos pequeños muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales. Las n = 12 hojas se recolectaron de 4 a 6 plantas diferentes. La significación estadística se determina mediante una prueba t no pareada bilateral (hojas infectadas con Xcc* versus hojas infectadas con XccΔxopD*: 1 DPI, P = 0,178; 3 DPI, P = 0,581; 5 DPI, P = 0,124; 7 DPI, P = 0,731 ). ns, no significativo (P > 0,05).

Datos fuente

Texto complementario.

Tablas complementarias 1 a 8. Tabla complementaria 1: Expresión génica diferencial entre nuc+XopD y nuc-XopD. Tabla complementaria 2: Enriquecimiento de GO en el proceso biológico de genes expresados ​​de manera significativamente diferencial. Tabla complementaria 3: Perfiles de todos los DMR CG-, CHG- y CHH- que comparan nuc+XopD con nuc-XopD. Tabla complementaria 4: Los 19 DEG con DMR ubicados dentro de regiones promotoras proximales de 3 kb. Tabla complementaria 5: Cambios de expresión de genes de defensa relacionados con SA seleccionados en nuc+XopD frente a nuc-XopD. Tabla complementaria 6: Secuencias de cebadores. Tabla complementaria 7: Plásmidos y cepas Xcc utilizadas en este estudio. Tabla complementaria 8: Características de los datos de RNA-seq y Mmethyl-seq.

Datos de fuente estadística.

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Reimpresiones y permisos

Usted, Y., Koczyk, G., Nuc, M. et al. El sistema eINTACT analiza la explotación bacteriana de la osmoseñalización de las plantas para mejorar la virulencia. Nat. Plantas 9, 128-141 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01302-y

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Recibido: 30 de noviembre de 2021

Aceptado: 28 de octubre de 2022

Publicado: 22 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01302-y

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