Evidencia de transferencia horizontal de genes entre simbiontes de nódulos foliares obligados

The ISME Journal volumen 10, páginas 2092–2105 (2016)Cite este artículo

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Las bacterias del género Burkholderia establecen una simbiosis obligada con especies de plantas de las familias Rubiaceae y Primulaceae. Las bacterias, alojadas dentro de las hojas, se transmiten de forma hereditaria y aún no se han cultivado. Hemos secuenciado y comparado los genomas de ocho simbiontes de nódulos foliares bacterianos de la familia de plantas Rubiaceae. Todos los genomas exhiben características consistentes con la erosión del genoma. Los genes potencialmente implicados en la biosíntesis de kirkamida, un aminociclitol C7N insecticida, se conservan en la mayoría de los simbiontes de Rubiaceae. Sin embargo, algunos han perdido parcialmente la vía de la kirkamida debido a la erosión del genoma y no pueden sintetizar el compuesto. Por tanto, la síntesis de kirkamida no es responsable de la naturaleza obligada de la simbiosis. Más importante aún, encontramos evidencia de eventos de transferencia horizontal de genes (HGT) dentro del clado que afectan a los genes del metabolismo secundario. Esto indica que puede ocurrir un flujo sustancial de genes en las primeras etapas después de la restricción del huésped en las simbiosis de nódulos foliares. Proponemos que los eventos de cambio de huésped y las transferencias conjugativas de plásmidos podrían haber promovido estos HGT. Este análisis genómico de simbiontes de nódulos foliares proporciona, por primera vez, nuevos conocimientos sobre la evolución del genoma de simbiontes obligados en sus primeras etapas de asociación con plantas.

Muchos microbios pueden establecer una amplia gama de interacciones beneficiosas con las plantas, contribuyendo a menudo a su nutrición, por ejemplo, a la adquisición de minerales o la fijación de nitrógeno, o a la defensa de las plantas mediante la síntesis de metabolitos secundarios (Sachs y Simms, 2006). La mayoría de estas asociaciones mutualistas son facultativas y han sido ampliamente estudiadas (Philippot et al., 2013).

A diferencia de las simbiosis animales, donde el ciclo de vida del simbionte suele estar ligado al huésped, las simbiosis con transmisión vertical son extremadamente raras en las plantas superiores (Leigh, 2010). Sólo se conoce un caso en el que el simbionte bacteriano se transmite verticalmente y su presencia es crítica para el desarrollo del huésped. Esta simbiosis única se establece entre bacterias del género Burkholderia y algunas especies de la familia Rubiaceae y Primulaceae.

La simbiosis de nódulos foliares se caracteriza por la presencia de estructuras especializadas dentro de las hojas llamadas agallas o nódulos (Miller, 1990). Esta asociación ha sido descrita en tres géneros de Rubiaceae: Psychotria, Pavetta y Sericanthe (Lemaire et al., 2012). Las especies noduladas son endémicas de África tropical y subtropical, y la mayoría de las Psychotria noduladas se encuentran en hábitats de sabana (Lachenaud, 2013). Los estudios morfológicos y ontológicos de principios del siglo XX revelaron la presencia de bacterias extracelulares dentro de los nódulos foliares de Psychotria (Zimmermann, 1902; Von Faber, 1912). Estas bacterias se detectaron además en todas las etapas de la vida de la planta, lo que sugiere un ciclo simbiótico cerrado, en el que los simbiontes bacterianos podrían transmitirse hereditariamente mediante la colonización de las semillas. Las bacterias son esenciales para el desarrollo de las plantas, ya que las semillas tratadas con calor germinan en plántulas aposimbióticas que no alcanzan la madurez y mueren después de varios meses (Miller, 1990; Van Oevelen et al., 2001). Por el contrario, las bacterias han perdido su autonomía y aún no han sido cultivadas fuera del huésped. Sólo las técnicas moleculares independientes del cultivo asignaron las bacterias simbióticas al género Burkholderia (Van Oevelen et al., 2002).

El genoma de C andidatus Burkholderia kirkii, el simbionte del nódulo foliar de Psychotria kirkii, ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la evolución del genoma y la naturaleza molecular de esta simbiosis (Carlier y Eberl, 2012). El genoma de Ca. B. kirkii tiene la mitad del tamaño de otras Burkholderia asociadas a plantas de vida libre estrechamente relacionadas y contiene una gran cantidad de pseudogenes y elementos transponibles (Carlier y Eberl, 2012). Estas propiedades son comunes en simbiontes recientemente evolucionados y de transmisión vertical, como el cianobionte obligado del helecho acuático Azolla filiculoides (Ran et al., 2010), el simbionte facultativo de la mosca tsetsé Sodalis glossinidius (Belda et al., 2010) o el pulgón. Cinara tujafilina co-obliga al simbionte Serratia symbiotica (Manzano-Marín y Latorre, 2014), lo que sugiere que Ca. B. kirkii recientemente cambió a un estilo de vida restringido al huésped. El proceso de reducción del genoma está bien documentado en simbiontes intracelulares obligados de animales donde se cree que la restricción del huésped y el aislamiento celular de bacterias causan la acumulación de mutaciones nocivas, promueven la pérdida de genes y previenen la transferencia horizontal de genes (THG) (McCutcheon y Moran, 2012). ).

Aún se desconoce la naturaleza molecular de la simbiosis de los nódulos foliares. Las especulaciones anteriores, incluida la producción de hormonas y la fijación de nitrógeno (Centifanto y Silver, 1964; Edwards y Lamotte, 1975), han sido descartadas con la información genómica y proteómica obtenida del Ca. B. kirkii (Carlier y Eberl, 2012; Carlier et al., 2013). En cambio, la evidencia genómica y química sugiere un papel protector de las plantas de las bacterias de los nódulos foliares. El análisis funcional de Ca. El genoma de B. kirkii reveló la presencia de un grupo de genes biosintéticos para aminociclitoles derivados de 2-epi-5-epi-valiolona de la familia de aminociclitol C7N. Estos genes, ubicados en el plásmido pKIR01 de 140 kb, probablemente estén involucrados en la síntesis de kirkamida, un aminociclitol C7N que se encuentra en las hojas de P. kirkii nodulada pero que está ausente en especímenes aposimbióticos atrofiados (Sieber et al., 2015). Curiosamente, no se han encontrado homólogos del supuesto grupo de biosíntesis de aminociclitol C7N en otras especies de Burkholderia, lo que indica que estos genes probablemente fueron adquiridos hace relativamente poco tiempo por HGT (Carlier y Eberl, 2012). La kirkamida pura es citotóxica e insecticida y, por lo tanto, puede aumentar la aptitud de la planta mediante la protección contra la herbivoría (Sieber et al., 2015).

El objetivo de este estudio fue (i) caracterizar el proceso de reducción del genoma en simbiontes obligados de nódulos foliares y comparar nuestros hallazgos con los modelos clásicos inferidos del estudio de simbiontes animales intracelulares transmitidos verticalmente (ii) investigar la importancia del metabolismo secundario para la simbiosis e (iii) identificar determinantes genéticos potencialmente involucrados en la naturaleza obligada de la simbiosis. Nuestros resultados muestran que la producción de metabolitos secundarios de aminociclitol C7N se conserva en la mayoría de los simbiontes de nódulos foliares, destacando la importancia del metabolismo secundario para la simbiosis. Además, demostramos que los eventos de infección cruzada pueden explicar la falta de una coevolución estricta. También proporcionamos evidencia de eventos recientes de HGT de genes biosintéticos de aminociclitol C7N. En conjunto, nuestros datos sugieren que en los simbiontes de nódulos foliares, la restricción del huésped y las primeras etapas de reducción del genoma no impiden el flujo de genes.

Para este estudio se seleccionaron siete especies de plantas de la familia Rubiaceae y el material se obtuvo del Jardín Botánico Nacional de Bélgica (los números de adquisición de la colección se dan entre paréntesis cuando están disponibles), excepto Psychotria punctata, cuyo material se obtuvo de un espécimen autenticado conservado. en el invernadero del Departamento de Biología Vegetal y Microbiana de la Universidad de Zurich. Las especies utilizadas en este estudio son: Psychotria humilis número de adquisición de colección: BR2009135940, Psychotria pumila (BR2004143571), Psychotria verschuerenii (BR19750204), Psychotria umbellata (BR2007130262), Psychotria brachyanthoides (BR2009844596), Psychotria punctata y Pavetta schu maniana (BR2000194257). Se obtuvieron hojas secadas con sílice de especímenes individuales del Jardín Botánico de Meise para todas las especies excepto P. punctata, para la cual se obtuvo material fresco (ver más abajo). Se diseccionaron alrededor de 1000 nódulos por muestra que contenían bacterias simbióticas utilizando una herramienta de perforación Harris Uni-core de 2,0 mm (Whatman Inc., Kent, Reino Unido) y se rehidrataron en 5 ml de tampón TNE (ácido etilendiaminotetraacético 100 mM, NaCl 200 mm, 10 mm Tris.Cl pH8) en hielo durante 1 h. Los nódulos rehidratados se trituraron con un mortero. Los restos vegetales se eliminaron filtrando a través de un filtro de nailon Millipore de 10 μm. Se recogió el flujo y se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación a 6000 rpm. El ADN de alto peso molecular se extrajo según Wilson (2001). La calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y amplificación por PCR del gen bacteriano del ARN ribosómico 16S. Los niveles de contaminación del ADN vegetal en preparaciones de ADN genómico se evaluaron mediante PCR semicuantitativa utilizando cebadores diseñados en el gen rbcL del cloroplasto de P. kirkii (5′-CCGGTACTGTAGTCGGGAAA y 5′-CCAAAGATCTCCGTCAGAGC) y estándares que consisten en ADN libre de bacterias preparado a partir de ADN no bacteriano. partes noduladas de las plantas investigadas. La proporción de ADN genómico bacteriano en nuestras preparaciones de nódulos fue consistentemente superior al 80% (p/p).

Nódulos foliares que contienen Ca. B. punctata se obtuvieron de un espécimen de P. punctata conservado en el jardín botánico de la Universidad de Zurich. Las bacterias se separaron del material vegetal mediante centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con un protocolo publicado previamente (Carlier y Eberl, 2012). El ADN genómico se preparó como se describe anteriormente.

El ADN genómico se secuenció en el Centro de Genómica Funcional de Zurich (FGCZ). Se prepararon bibliotecas de 250 pb de extremos emparejados utilizando el kit Nextera XT (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) y se secuenciaron utilizando la plataforma de secuenciación Illumina Miseq. Las lecturas se prepararon para el ensamblaje utilizando la función de recorte del adaptador del software Scythe (https://github.com/vsbuffalo/scythe) y las lecturas de secuenciación con una puntuación Phred inferior a 30 se eliminaron utilizando el paquete FastQC (http://www. bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc). La cobertura promedio para las siete muestras secuenciadas fue de 50 × y la longitud de las lecturas fue de 230 pb en promedio. Para ensamblar lecturas de secuenciación de origen bacteriano a partir de muestras que contienen genomas de plantas contaminantes, se utilizó un enfoque de agrupamiento (Albertsen et al., 2013). El ensamblaje preliminar de las lecturas se realizó utilizando CLC Genomics Workbench v7.0 (//www.clcbio.com) (CLC Bio-Qiagen, Aarhus, Dinamarca) con parámetros de baja rigurosidad. El contenido de guanina y citosina (GC) y la cobertura de lectura promedio de los contigs resultantes se trazaron utilizando el paquete ggplot implementado en R (Wickham, 2009) (Figura complementaria S1). Debido a que los genomas de las plantas son varios órdenes de magnitud más grandes que los de los simbiontes y tienen un% de GC bajo, se seleccionaron grupos de cóntigos con alta cobertura (aprox. por encima de 70 ×) y un alto% de GC como cóntigos bacterianos y el resto se considerados contaminantes de las plantas. Para evitar falsos positivos, se buscaron todos los contigs en la base de datos nt del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) utilizando el software Blast (Altschul et al., 1990). Las lecturas de secuenciación con un par de parejas mapeadas se extrajeron de los contigs asignados a los genomas bacterianos utilizando SAMtools (Li et al., 2009) y scripts Python ad-hoc. Las lecturas extraídas se utilizaron para el ensamblaje de novo utilizando el ensamblador SPAdes v3.0 con longitudes de k-mer de 55, 77 y 100 (Bankevich et al., 2012). El programa QUAST se utilizó para generar las estadísticas resumidas del ensamblaje (N50, longitud máxima de contig, GC%) (Gurevich et al., 2013). La longitud total de los contigs se utilizó para estimar el tamaño del genoma.

El ensamblaje parcial del genoma del cloroplasto se realizó mapeando las lecturas de secuenciación utilizando CLC Genomics Workbench v7.0 (http://www.clcbio.com; CLC Bio-Qiagen) en el genoma del cloroplasto de P. kirkii, obtenido como parte del Ca. Proyecto de secuenciación de B. kirkii (Carlier y Eberl, 2012).

ADN genómico de Ca. B. punctata se utilizó para la preparación y secuenciación de bibliotecas en tiempo real (SMRT) de una sola molécula utilizando la química P2 en el instrumento RSII de Pacific Biosciences (PacBio) en la FGCZ. Se secuenció una biblioteca de insertos de 0,5 kb utilizando 13 células SMRT para generar lecturas de secuencia de consenso circular de alta calidad. Se secuenció una segunda biblioteca de insertos de 6 kb utilizando cuatro células SMRT para generar lecturas largas continuas. Los datos de lectura sin procesar se filtraron y analizaron utilizando el canal PacBio SMRTportal v1.4. Las lecturas largas de alta calidad se generaron mapeando las lecturas de secuencia de consenso circular en lecturas largas continuas utilizando la utilidad PacBiotoCA del paquete ensamblador Celera (Koren et al., 2013). El ensamblaje de las lecturas corregidas se realizó utilizando el software MIRA v3.4 (Chevreux et al., 1999). Se obtuvieron y editaron cuarenta y nueve contigs con una cobertura promedio de 42 × en GAP5 (Bonfield y Whitwham, 2010).

Se detectaron marcos de lectura abiertos con el software Prodigal (Hyatt et al., 2010), genes de ARN de transferencia usando tRNAscan (Schattner et al., 2005) y genes de ARN ribosomal con RNAmmer (Lagesen et al., 2007). Las secuencias de codificación de ADN se anotaron con el servicio de anotación en línea de tecnología de subsistema (RAST) y la información metabólica se obtuvo de la herramienta de anotación de genes y genomas de la enciclopedia de Kyoto implementada en RAST (Aziz et al., 2008). La información de ontología genética se recopiló utilizando el programa Blast2GO (Conesa et al., 2005) y la predicción de la localización subcelular se llevó a cabo utilizando InterProScan (Zdobnov y Apweiler, 2001). Los tramos de secuencia de más de 1 kb que carecían de anotaciones, posiblemente debido al uso de codones divergentes o al sesgo de GC, se anotaron manualmente con Artemis y el paquete de software NCBI Blast (Altschul et al., 1990; Rutherford et al., 2000). Los genes y pseudogenes funcionales se predijeron de acuerdo con el proceso desarrollado por Carlier et al., 2013. Además, los pseudogenes se anotaron mediante la búsqueda de homología de regiones intergénicas utilizando el programa NCBI blastx en comparación con una base de datos personalizada de secuencias de proteínas predichas a partir de genomas de Burkholderia. Solo se consideraron los aciertos con más del 50% de identidad y con un valor e <10-6. Las regiones afectadas se alinearon con la secuencia de proteínas del sujeto con mejor puntuación utilizando el programa tfasty del paquete de software FASTA v3.6 para encontrar los límites de los pseudogenes (Pearson, 2000). La asignación de pseudogenes a categorías funcionales COG se realizó utilizando la secuencia de la proteína con mejor impacto explosivo (ver más abajo).

Las secuencias repetitivas se detectaron con el programa RepeatScout v1.0.5 (Price et al., 2005). Para caracterizar la diversidad de secuencias de inserción (IS), se analizó todo el genoma con ISsaga (Varani et al., 2011). Para refinar la anotación, se buscaron repeticiones de más de 500 pb en la base de datos ISfinder utilizando el programa NCBI blastx. Los genomas anotados se depositaron en Genbank con los números de acceso LFMX00000000, LFLF00000000, LFKV00000000, LFJJ00000000, LFJI00000000, LELG00000000 y LFJH00000000.

Para revelar las relaciones filogenéticas entre los simbiontes de nódulos foliares de Burkholderia y otras especies de Burkholderia asociadas a plantas, reconstruimos un árbol filogenético de máxima probabilidad de una alineación concatenada de 534 ortólogos de copia única. Las secuencias de aminoácidos se alinearon con MUSCLE (Edgar, 2004) y se tradujeron nuevamente a nucleótidos con T-Coffee (Notredame et al., 2000). Las posiciones del alineamiento con huecos en más del 50% de las secuencias se eliminaron con TrimAl (Capella-Gutiérrez et al., 2009). La reconstrucción de máxima probabilidad se realizó utilizando RAxML v8.0 (Stamatakis, 2014) con el modelo de sustitución de nucleótidos GTRGAMMA y 1000 análisis de arranque rápido. Se obtuvieron genes ortólogos uno a uno comparando una base de datos genómica que comprende seis especies de Burkholderia con una asociación beneficiosa con plantas (B. phymatum STM815, B. phytofirmans PsJN, B. xenovorans LB400, B. sp. CCGE1001, B. sp. CCGE1002 , B. sp. CCGE1003), tres que se encuentran comúnmente en el suelo (B. sp. YI23, B. sp. SJ98, B. glathei), un simbionte de chinche del frijol (B. sp. RPE64) y ocho simbiontes de nódulos foliares de Burkholderia (Ca . B. kirkii, Ca. B. punctata, Ca. B. humilis, Ca. B. umbellata, Ca. B. schumanniana, Ca. B. verschuerenii, Ca. B. brachyanthoides, Ca. B. pumila). Para enraizar el árbol utilizamos dos especies (B. cenocepacia J2315 y B. ambifaria AMMD) pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia (Suárez-Moreno et al., 2012).

El árbol de máxima probabilidad para las siete especies de plantas se obtuvo a partir de una alineación concatenada de un segmento conservado de 30 kb de la secuencia del genoma del cloroplasto. La región conservada se identificó en los genomas utilizando el software Mauve (Darling et al., 2010) y se alineó utilizando el algoritmo MUSCLE con configuraciones estándar. La secuencia del cloroplasto de Pa. schumanniana se utilizó como grupo externo para enraizar el árbol (Denoeud et al., 2014).

Para determinar las tasas evolutivas de los simbiontes de nódulos foliares, se estimaron tasas de sustituciones sinónimas (dS) y no sinónimas (dN) para las familias de genes con estrictamente un ortólogo en cada una de las ocho especies. Las secuencias de proteínas para cada grupo de ortólogos se alinearon con MUSCLE (Edgar, 2004) y las alineaciones de codones de nucleótidos posteriores se generaron y recortaron utilizando el script Perl Pal2nal (Suyama et al., 2006).

Los valores dN/dS por pares se estimaron con el módulo Codeml del paquete PAML v4.4 utilizando las siguientes configuraciones (modelo = −2 y frecuencia de codones = 2) (Yang, 2007). Los genes con valores de dS cercanos a la saturación (dS>2) fueron excluidos de los análisis.

Para aumentar la sensibilidad, analizamos sitios bajo selección positiva con una prueba de modelo de sitio (Yang y dos Reis, 2011) implementada en Codeml. Contrastamos el modelo nulo M7 (con distribución beta para ω) con el modelo alternativo M8 (distribución beta para ω y una clase adicional de sitios bajo selección positiva con ω>1). Se realizó la prueba de razón de verosimilitud para cada modelo y los resultados se compararon con una distribución χ2 con dos grados de libertad y un valor alfa de 0,01.

Se asignaron categorías funcionales de grupos de grupos ortólogos (COG) a cada marco de lectura abierto. Esto se logró con una explosión específica de posición invertida (RPS-BLAST) contra la base de datos del dominio conservado del NCBI (límite de valor e de 1 × 10-3). Se contaron los genes pertenecientes a cada categoría COG y las distribuciones se compararon utilizando una prueba de χ2 de Pearson con el paquete de software R (R Development Core Team., 2011).

Para comparar los genomas de simbiontes de nódulos foliares, las secuencias de proteínas predichas se agruparon utilizando el software OrthoMCL v1.4 con blastp recíproco (valor de corte e de 1e10-6 y 50% de identidad y 50% de corte de longitud de coincidencia) (Li et al. , 2003). Los genes centrales y accesorios de los simbiontes de nódulos foliares se definieron basándose en la agrupación de familias de genes como se describió anteriormente (Carlier y Eberl, 2012).

Se obtuvieron hojas enteras de cada espécimen de planta y se secaron sobre gel de sílice. Las muestras se trituraron hasta obtener un polvo, se maceraron en metanol durante 24 h, se filtraron y se secaron. Parte del extracto se disolvió en agua (500 μl), se filtró, se transfirió a un vial de cromatografía líquida de alta resolución y se secó mediante liofilización. Se añadió MSTFA (N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida) (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.), la mezcla se agitó durante 30 min a 70 °C, se añadió piridina (seca, mismo volumen que MSTFA). , y la reacción se filtró. Se analizaron muestras de 5 µl en un cromatógrafo de gases de la serie TRACE 1300 de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE. UU.) equipado con un espectrómetro de masas de cuadrupolo único de la serie Thermo Scientific ISQ utilizando una columna HP-Ultra-1 (Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.), 25 m × 0,200 mm, 0,35 μm). Las series de GC-MS se realizaron utilizando una temperatura inicial de 40 °C (mantenida durante 1 min), una rampa lineal de 7 °C min-1 y una temperatura final de 330 °C (mantenida durante 10 min). Como control, también se llevó a cabo la derivatización y el análisis GC-MS con kirkamida sintética y los datos se utilizaron como estándar analítico (consulte Métodos de información complementaria).

Se preparó una solución de ácido maleico como estándar interno (Sigma Aldrich, TraceCERT) a una concentración de 0,52 μmol ml-1 en D2O (99,9 % deuterado) y los experimentos de RMN se realizaron en un espectrómetro de RMN Bruker Avance III que operaba a 500 MHz de protones. frecuencia.

Los protones elegidos para el ácido maleico mostraron un cambio químico entre 6,30 y 6,20 ppm, para el glucósido de estreptol entre 5,966 y 5,941 ppm y para la kirkamida entre 5,887 y 5,874 ppm (Figura complementaria S2A). Se determinó el tiempo de retardo para estos protones y se encontraron valores de 7,5 s para ácido maleico, 1,7 s para glucósido de estreptol y 2,2 s para kirkamida. Las mediciones cuantitativas de 1H-NMR operaron con un retardo de relajación (D1) de 40 s, un número de escaneos (ns) de 128 o 256, un ancho espectral (sw) de 1,2 ppm y un desplazamiento del transmisor (O1) de 6 ppm. . El pico de agua a 4,79 ppm se utilizó como referencia para la calibración del pico de ácido maleico basándose en un segundo espectro de 1H-NMR registrado para cada medición. La concentración de glucósido de estreptol y kirkamida se calculó comparando su integración máxima con la medida para el ácido maleico. Para la determinación de kirkamida en el extracto de hojas de P. kirkii se llevó a cabo un experimento de mezcla añadiendo 40 µg de kirkamida sintética. Los extractos de hojas, preparados como se describe para la medición por GC-MS, se pesaron utilizando una balanza analítica (Mettler-Toledo XA105DU).

El ensamblaje de las lecturas de extremos emparejados de Illumina Miseq dio como resultado varios cientos de andamios para la mayoría de los genomas secuenciados (excepto C a. B. punctata, cuyo genoma se ensambló utilizando datos de lectura larga) y una cobertura promedio de más de 50 × (información detallada en Tabla 1). La fragmentación de los conjuntos fue causada principalmente por secuencias repetitivas derivadas de elementos móviles.

El análisis de los contigs mostró la presencia de una sola especie de bacteria simbiótica por muestra de planta. Los tamaños del genoma de los simbiontes de nódulos foliares secuenciados en este estudio variaron entre 2,4 Mb para Ca. B. schumanniana y 6,1 Mb para Ca. B. verschuerenii (Tabla 1). Los genomas también mostraron diferentes capacidades de codificación que van desde el 41,7% para Ca. B. pumila al 67,3% para Ca. B. verschuerenii (Figura 1).

Tamaños del genoma y proporciones de codificación del nódulo foliar Burkholderia. Las estimaciones del tamaño del genoma de todas las bacterias de los nódulos foliares se muestran en gris. La proporción del genoma codificante y sus correspondientes valores en porcentaje se muestran en negro.

La transición de una vida libre a una simbiosis obligada a menudo resulta en cambios marcados en la arquitectura del genoma (Moya et al., 2008; Toft y Andersson, 2010; McCutcheon y Moran, 2012). Además de un tamaño reducido del genoma y una capacidad de codificación, los simbiontes de los nódulos foliares comparten otros rasgos con los simbiontes obligados en las primeras etapas de la simbiosis, como la acumulación de pseudogenes y elementos transponibles (Toh et al., 2006; Burke y Moran, 2011; Oakeson et al., 2014). Alrededor del 60% de las regiones codificantes del ADN están interrumpidas por cambios de marco o mutaciones nulas y no se observó ningún sesgo significativo hacia la pérdida de ninguna categoría de gen funcional particular (Figura 2). Esto indica que la deriva genética es la principal fuerza evolutiva que impulsa la erosión de las funciones genéticas en los genomas de los simbiontes de los nódulos foliares, similar a lo que se ha observado para otros simbiontes obligados (Mira y Moran, 2002).

Distribución de los genes conservados en todos los simbiontes de nódulos foliares en categorías funcionales de COG. Para cada categoría COG, se comparó el número de genes funcionales (barras grises) y el número total de genes, incluidos los pseudogenes (barras negras). (J)=traducción, estructura ribosómica y biogénesis; (K)=transcripción; (L) = replicación, recombinación y reparación de ADN; (D) = división celular y partición cromosómica; (O)=modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas; (M) = biogénesis de la envoltura celular, membrana externa; (N)=motilidad y secreción celular/tráfico y secreción intracelular; (P)=transporte y metabolismo de iones inorgánicos; (T)=mecanismos de transducción de señales; (C)=producción y conversión de energía; (G)=transporte y metabolismo de carbohidratos; (E) = transporte y metabolismo de aminoácidos; (F)=transporte y metabolismo de nucleótidos; (H)=metabolismo de coenzimas; (I)=metabolismo de lípidos; (Q)=biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; (R)=sólo predicción de función general; (S)=función desconocida.

Los elementos transponibles son abundantes en todos los simbiontes de nódulos foliares y pueden tener un papel importante en los primeros pasos de la reducción del genoma. Al menos nueve familias diferentes de IS estaban representadas en simbiontes de nódulos foliares. La distribución de estas familias es irregular y la mayoría de los elementos móviles identificados carecen de una copia funcional en el genoma (Tabla complementaria S1). Sólo pudimos rastrear copias completas correspondientes a las familias IS3, IS4, IS5, IS66 e IS200 en varios genomas.

La variabilidad en el número de copias y la localización de elementos IS de la misma familia en genomas simbiontes de nódulos foliares sugiere que: (i) la proliferación de una familia IS en un genoma determinado se desencadena aleatoriamente y (ii) la reciente transición a un estilo de vida específico del huésped puede haber estimulado la rápida proliferación de elementos del EI. Estas observaciones están de acuerdo con el modelo puntuado neutral propuesto para la proliferación de elementos IS (Iranzo et al., 2014). Este modelo predice la inestabilidad del número de copias de IS después de un cambio en el entorno, como el que sigue al establecimiento de un estilo de vida específico del huésped. El hecho de que encontremos muchos IS inactivados o truncados en los genomas simbiontes de los nódulos foliares puede indicar un fuerte sesgo de eliminación general o un retorno a una condición más estable donde la multiplicación y eliminación de copias IS activas vuelven al equilibrio.

Todos los genomas simbiontes de nódulos foliares muestran una sintenia extremadamente baja, lo que es consistente con una extensa mezcla genómica causada por elementos transponibles. Comparamos el genoma de Ca. B. punctata, que podríamos reunir en grandes contigs, con el simbionte de la chinche apestosa, Burkholderia sp. RPE64. La alineación muestra en su mayoría pequeños bloques sinténicos de más de 100 kb. Por el contrario, B. sp., más lejanamente relacionada y de vida libre aislada en el suelo. YI23 muestra una sintenia relativamente alta con Burkholderia symbiont sp. RPE64 con tramos de ADN sintético que abarcan replicones completos (Figura complementaria S3). Se observan muchos reordenamientos dentro de los andamios y, en muchos casos, los bloques sinténicos están flanqueados por transposasas intactas o inactivadas. Esto sugiere que los elementos móviles, posiblemente en combinación con la recombinación homóloga, facilitaron los reordenamientos masivos del ADN observados en los genomas de los nódulos de las hojas.

El reordenamiento del genoma, la proliferación de IS y una gran cantidad de pseudogenes indican que la deriva genética es una fuerza impulsora importante en la configuración de los genomas de los simbiontes de los nódulos foliares. En otros simbiontes obligados y de transmisión vertical, se sabe que la deriva genética es la principal fuerza evolutiva que da forma a la arquitectura del genoma, mientras que la selección purificadora es menos efectiva (Kuo et al., 2009). Esto a menudo resulta en la acumulación de mutaciones nocivas (un proceso conocido como trinquete de Muller) (Muller, 1964; Felsenstein y Yokoyama, 1976; Moran, 1996; McCutcheon y Moran, 2012). Debido a que la erosión continua del genoma a menudo se traduce en altas tasas de sustituciones de no sinónimos (dN) a sinónimos (dS) en todo el genoma, calculamos las tasas de sustituciones dN/dS para los 798 ortólogos verdaderos en todos los genomas simbiontes de nódulos foliares. La relación dN/dS promedio fue de 0,07 (Figura 3), mientras que las bacterias de vida libre o simbiontes facultativos tienen una relación dN/dS promedio entre 0,02 y 0,06 (Kuo et al., 2009).

Tasas de sustitución sinónimos (dS) y no sinónimos (dN) inferidas de comparaciones por pares de los 798 genes ortólogos verdaderos (puntos grises) en todos los genomas simbiontes de nódulos foliares. Los diagramas de caja en los ejes adyacentes representan la distribución de los valores dS y dN y los valores atípicos.

Hasta ahora, nuestras observaciones son consistentes con lo que se ha descrito para otros simbiontes obligados, incluidos los endosimbiontes de insectos (McCutcheon y Moran, 2012). En estos, la selección relajada generalmente resulta en un enriquecimiento del genoma en adenina y timina (A+T) y un menor porcentaje de GC en simbiontes obligados en comparación con parientes de vida libre (McCutcheon y Moran, 2012). Por el contrario, el porcentaje promedio de GC de los genomas de simbiontes de nódulos foliares (60–63%) está dentro del rango de Burkholderia de vida libre relacionada (62–65%). Una razón para el alto porcentaje de GC de los genomas puede atribuirse a la edad relativamente joven de la simbiosis y al hecho de que los mecanismos de reparación del ADN aún están intactos en la mayoría de los simbiontes de nódulos foliares. Sin embargo, el% de GC promedio de los pseudogenes, que se podría suponer que están bajo selección relajada, no es significativamente diferente del de los genes funcionales (Tabla complementaria S2). En otros organismos, los pseudogenes tienen un% de GC más bajo que sus contrapartes funcionales (Lerat y Ochman, 2004). Esta falta de desviación del% promedio de GC sugiere, en cambio, que las sustituciones no están sesgadas hacia A+T en los simbiontes de nódulos foliares de Burkholderia. Esta interpretación está respaldada por datos experimentales que demuestran un sesgo mutacional inusual hacia G+C en otras especies de Burkholderia (Dillon et al., 2015).

Calculamos el genoma central de los simbiontes de nódulos foliares y lo comparamos con el genoma central de 52 especies de Burkholderiaceae de vida libre, que sirven como una aproximación del conjunto de genes esenciales de las especies de Burkholderia (Juhas et al., 2012). El genoma central de los simbiontes de nódulos foliares contiene 798 genes y solo faltaban siete genes centrales de Burkholderiaceae en todos los genomas simbiontes de nódulos foliares. Sin embargo, ninguno de ellos parece pertenecer a ninguna vía metabólica esencial (Tabla complementaria S3), lo que sugiere que a pesar de la reducción desenfrenada del genoma, los simbiontes de nódulos foliares pueden no depender del huésped para funciones domésticas esenciales. Esto confirma indirectamente la suposición anterior de que la incapacidad de desarrollar bacterias de nódulos foliares axénicamente puede deberse a su falta de adaptabilidad a las condiciones ambientales cambiantes (Carlier y Eberl, 2012).

También exploramos el conjunto de genes no esenciales (genes accesorios de Burkholderia de vida libre) conservados en todos los genomas de simbiontes de nódulos foliares para encontrar vías específicas que podrían ser importantes para la simbiosis o para la vida como endófito. Identificamos 314 genes no esenciales, en su mayoría involucrados en el metabolismo de la coenzima y la biogénesis de la envoltura celular y la membrana externa que se conservaron en todos los simbiontes de nódulos foliares de Rubiaceae (Figura complementaria S4, Tabla complementaria S4).

Entre los genes implicados en el metabolismo de las coenzimas, pudimos identificar vías completas para la biosíntesis de tiamina, cobalamina y glutatión. Se sabe que estas vitaminas promueven las interacciones entre plantas y microbios y, por lo tanto, podrían ser potencialmente importantes para la naturaleza obligada de la simbiosis de los nódulos foliares. Solo se ha descrito un caso de simbiosis dependiente de cobalamina, concretamente entre el alga Volvox carteri y su simbionte cianobacteria (Helliwell et al., 2011). A diferencia de las algas, las plantas superiores no necesitan cobalamina y no pueden producirla. La biosíntesis de cobalamina se limita únicamente a las bacterias donde la vitamina actúa como cofactor para múltiples enzimas como la metionina sintasa (Banerjee y Ragsdale, 2003). Los simbiontes de nódulos foliares conservan la versión dependiente de cobalamina de la metionina sintasa y una vía biosintética completa de cobalamina. Las cantidades de Met libre en los análisis de cromatografía líquida de ultra rendimiento de extractos de P. kirkii aposimbióticos fueron indistinguibles de las plantas noduladas, lo que sugiere que los simbiontes de nódulos foliares sintetizan Met para satisfacer sus propias necesidades metabólicas y no las del huésped (datos no mostrados).

Los antioxidantes bacterianos pueden actuar como un mecanismo de defensa contra las especies de oxígeno reactivo de las plantas (Nanda et al., 2010). Se ha demostrado ampliamente que la relevancia de los eliminadores de especies reactivas de oxígeno enzimáticas y no enzimáticas, como la enzima superóxido dismutasa y el glutatión, en las interacciones entre plantas y microbios es importante en las simbiosis entre leguminosas y rizobios (Santos et al., 2000; Rubio et al., 2004; Pauly et al., 2006). Estas funciones de eliminación (por ejemplo, la superóxido dismutasa se conservan en todos los simbiontes de nódulos de hojas, lo que indica que también pueden tener un papel importante para la simbiosis y tal vez la formación de nódulos (Tabla complementaria S4). Alternativamente, los mecanismos para hacer frente a las especies reactivas de oxígeno podrían ser necesario para sobrevivir en el duro ambiente fotooxidativo de la hoja (Triantaphylidès et al., 2008).

Como se mencionó anteriormente, los simbiontes de nódulos foliares comparten genes no esenciales responsables de la biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS), que pueden ser importantes para el reconocimiento huésped-simbionte (Raetz y Whitfield, 2002). Los lipopolisacáridos son "patrones moleculares asociados a microbios" que constituyen el componente principal de la superficie celular (Boller y Felix, 2009). Se consideran la primera barrera contra las defensas de las plantas y median la comunicación con la planta huésped (Soto et al., 2009). Como los simbiontes de los nódulos foliares colonizan especies de plantas de la misma familia, se esperaba una composición estructural similar del antígeno O. Sin embargo, el grupo potencialmente involucrado en el ensamblaje, modificación y exportación (Bkir_c27_1818–1838) no está completamente conservado en todos los nódulos foliares y algunos de ellos incluso carecen de una enzima glicosiltranferasa (Bkir_c27_1818), presumiblemente involucrada en el ensamblaje del antígeno O. La ausencia de un grupo conservado para la síntesis del antígeno O en simbiontes de nódulos foliares no descarta por completo la posibilidad de que el lipopolisacárido esté involucrado en la comunicación simbiótica. Sin embargo, el lipopolisacárido no parece ser el mediador principal y otros patrones moleculares asociados a microbios (por ejemplo, GroEL, factor de elongación, peptidoglicano, etc.) podrían estar implicados en el reconocimiento del simbionte (Newman et al., 2013; Chaudhary et al., 2014).

La transmisión vertical de simbiontes bacterianos a través de la línea germinal del huésped es una de las estrategias más frecuentes para el mantenimiento de la simbiosis obligada y, a menudo, da como resultado una congruencia filogenética o co-especiación entre parejas (Moran et al., 1993; Russell y Moran, 2005). ; Sloan y Moran, 2012). A pesar de la especificidad del huésped y la transmisión vertical de los simbiontes de los nódulos foliares, las filogenias de las especies de Rubiaceae y sus simbiontes de Burkholderia son incongruentes. Se ha propuesto un modo de transmisión vertical con transmisión horizontal ocasional para explicar esta falta de coevolución estricta (Lemaire et al., 2011). Además, la presencia entrelazada de aislados de suelo de Burkholderia y simbiontes de insectos dentro del clado filogenético de simbiontes de nódulos foliares sugiere múltiples fuentes de transmisión (plantas, insectos y suelo).

La incongruencia entre las filogenias de huéspedes y simbiontes sugiere que el modo de transmisión de las bacterias es mixto en lugar de estrictamente vertical (Figura 4). Lo más intrigante es que detectamos un llamativo cambio de huésped o evento de reinfección entre P. kirkii/Ca. B. kirkii y Pa. schumanniana/Ca. B. schumanniana pares de especies. Los simbiontes bacterianos están estrechamente relacionados y comparten grados similares de reducción del genoma a pesar de haber divergido hace <300 000 años (Figura complementaria S5). Sin embargo, P. kirkii y Pa. schumanniana pertenecen a géneros distintos que se cree que divergieron hace más de 60 millones de años (Lemaire et al., 2011). La explicación más simple es que el simbionte de Pa. schumanniana fue reemplazado recientemente por el simbionte de nódulos foliares de P. kirkii. La posibilidad de una reinfección por bacterias que viven en un reservorio del suelo como se había planteado anteriormente (Lemaire et al., 2012) parece poco probable. El alto grado de reducción del genoma, junto con la altísima homología de secuencia observada entre los genomas de los simbiontes de Pa. schumanniana y P. kirkii, sugieren más bien que ambas especies han estado restringidas a un huésped durante millones de años. La probabilidad de cambios de huésped puede aumentar por la superposición de los rangos geográficos de P. punctata, P. kirkii y Pa. schumanniana (Bremekamp, ​​1934; Lachenaud, 2013).

Reconstrucción filogenética de máxima probabilidad de especies de Burkholderia (izquierda) y Psychotria (derecha). El árbol de Burkholderia se reconstruyó basándose en el análisis de una alineación concatenada de 534 genes ortólogos verdaderos. La reconstrucción de la especie vegetal Psychotria se basó en un fragmento conservado en cloroplasto de 30 kb. En verde se destacan los simbiontes bacterianos de nódulos foliares de especies de plantas Psychotria. El simbionte bacteriano del nódulo foliar de la especie vegetal Pavetta está resaltado en azul. Resaltado en rojo está un simbionte de Riptortus (chinche apestosa) y en marrón, aislados del suelo. Se utilizó Burkholderia ambifaria AMMD como grupo externo (no se muestra). Se muestran los valores de Bootstrap.

Una pista sobre el mecanismo de transmisión simbionte entre plantas puede provenir del clado anidado de aislamientos del suelo (B. sp. YI23 y B. sp. SJ98) y del simbionte apestoso Riptortus pedestris (B. sp. RPE64), que forman un simbionte hermano. grupo con Ca. B. punctata, Ca. B. kirkii y Ca. B. schumanniana (Figura 4). Aislados de Burkholderia, B. sp. YI23 y B. sp. SJ98, han sido aislados del suelo y son capaces de degradar los pesticidas 2-cloro-4-nitrofenol (en B. sp. SJ98) (Min et al., 2014) y fenitrotión (en B. sp. YI23) (Lim et al., 2014). otros, 2012). B. sp. RPE64 se ha aislado de chinches (Kikuchi et al., 2012). Este grupo de especies de Burkholderia, al que pertenecen los simbiontes de nódulos foliares de Rubiaceae, viven libremente en el suelo o están asociados con plantas e insectos. Por lo tanto, se puede imaginar que el antepasado de los simbiontes de los nódulos foliares fue una especie de Burkholderia con una gama de huéspedes notablemente amplia. Por lo tanto, es concebible que algunas de las especies de nódulos foliares hayan conservado la capacidad de asociación transitoria con insectos, que podrían actuar como vectores potenciales (mientras que los insectos no vectores pueden ser objetivos de la actividad insecticida de la kirkamida).

Para obtener una mejor comprensión de los determinantes de la simbiosis foliar, nos centramos en los genes presentes únicamente en los simbiontes de nódulos foliares y ausentes en otras especies de Burkholderia estrechamente relacionadas. La comparación del genoma de los simbiontes de nódulos foliares bacterianos con 19 especies de Burkholderia estrechamente relacionadas reveló sólo un gen que es exclusivo del linaje de nódulos foliares. Este gen codifica una supuesta 2-epi-5-epi-valiolona sintasa, involucrada en el primer paso de los aminociclitoles derivados de 2-epi-5-epi-valiolona de la familia de aminociclitol C7N. Una inspección más cercana reveló que el gen está truncado en Ca. B. brachyanthoides, y la biosíntesis de aminociclitoles C7N parece haberse perdido en esta especie (Tabla 2). Sin embargo, el genoma central de los otros siete genomas contiene un conjunto de seis genes (2-epi-5-epi-valiolona sintasa, N-acetilmanosamina quinasa, azúcar hidrolasa, glicosidasa, azúcar deshidrogenasa, familia de N-acetiltransferasa relacionada con Gcn5) potencialmente involucrado en la síntesis de la molécula de kirkamida (Tabla 2). Casi todos los genes están conservados y están en el mismo orden genético y sólo la acetiltransferasa está en una ubicación diferente en Ca. B. humilis. Curiosamente, este grupo de genes está en algunos casos flanqueado por restos de elementos transponibles (Figura complementaria S6).

Debido a que el ancestro común de todos los simbiontes modernos de nódulos foliares de Rubiaceae probablemente poseía un metabolismo secundario de aminociclitol C7N, especulamos que la adquisición de la capacidad de sintetizar este compuesto protector permitió el cambio de un estilo de vida quizás comensal a uno mutualista. Sin embargo, el metabolismo secundario y la ventaja de aptitud física asociada por sí solos no explican la estricta dependencia de la planta huésped de la presencia de bacterias, que pueden haber evolucionado de forma independiente (De Mazancourt et al., 2001; Leigh, 2010; Sachs et al., 2011). ).

Para probar esto, analizamos extractos de hojas para detectar kirkamida mediante GC-MS y 1H-NMR (consulte Métodos de información complementaria). Pudimos detectar kirkamida en extractos de hojas de P. kirkii, P. punctata, P. verschuerenii, P. humilis y P. pumila (Tabla 2, Figuras complementarias S2D y E) y se determinaron concentraciones que oscilaban entre el 0,2 y el 0,4% del peso seco. determinado en hojas de P. kirkii y P. punctata. Todas estas especies albergan la supuesta vía biosintética de kirkamida. Por el contrario, no pudimos detectar kirkamida en extractos de P. brachyanthoides, cuyos simbiontes han perdido la mayor parte del grupo de biosíntesis de kirkamida. Tampoco pudimos detectar kirkamida en extractos de Pa. schumanniana y P. umbellata, ambas especies albergan las enzimas de la vía de kirkamida (Tabla 2, Figuras complementarias S2D y E). Curiosamente, un supuesto gen transportador de la superfamilia facilitador principal unido al operón kirkamida es un pseudogén en Ca. B. umbellata. El gen ortólogo en Ca. B. schumanniana se separa del operón kirkamida principal después de un reordenamiento mediado por IS. Por tanto, es posible que el transporte de kirkamida o de precursores esté comprometido en ambos organismos. Una hipótesis alternativa es que se produce otro aminociclitol C7N no detectado en P. umbellata y Pa. schumanniana. Podríamos, por ejemplo, aislar un nuevo compuesto de ciclitol C7, el glucósido de estreptol (Figura complementaria S2A) de las hojas de P. kirkii. La estructura es epimérica en el centro anomérico en comparación con A-79197-2, que se aisló de una especie epífita de Actinomyces (Kizuka et al., 2002) (Figura complementaria S2F). Debido a que el glucósido de estreptol muestra una fuerte inhibición de la germinación de las semillas de lechuga (confirmada con el compuesto purificado de P. kirkii), podría conferir una ventaja alelopática a P. kirkii (ver Métodos de información complementaria). El repertorio enzimático de la planta huésped también podría contribuir a la diversidad de metabolitos secundarios producidos por la asociación.

La falta de sintenia completa en los genes de metabolitos secundarios conservados y la presencia de elementos transponibles flanqueantes sugieren que podrían haber ocurrido eventos HGT. Esto también está respaldado por la incongruencia de las filogenias genéticas, lo que indica múltiples eventos de HGT dentro del clado de los simbiontes de nódulos foliares (Figura complementaria S7). Aunque la biosíntesis de aminociclitol C7N probablemente estuvo presente en el antepasado de los simbiontes de nódulos foliares modernos, la HGT parece haber ocurrido al menos dos veces (Figura complementaria S8). Debido a que los supuestos genes biosintéticos de kirkamida están ubicados en el plásmido pKIR01 en Ca. B. kirkii, la transferencia conjugativa podría explicar los árboles filogenéticos mixtos de los genes del metabolismo secundario de los simbiontes de los nódulos foliares. Anteriormente identificamos el gen repA de pKIR01, ubicado en las inmediaciones de un par de genes de partición parA/parB y posiblemente codifica una proteína de iniciación de la replicación (Carlier y Eberl, 2012; Carlier et al., 2013). Podríamos recuperar secuencias completas o parciales de homólogos de repA de todos los genomas de simbiontes de nódulos foliares (Figura complementaria S9). Sorprendentemente, pudimos detectar dos copias de repA en el genoma de Ca. B. kirkii, uno de los cuales es un pseudogén, perteneciente a una rama distinta del árbol repA. Esta es una evidencia clara de que la adquisición del replicón pKIR01 ocurrió al menos dos veces en Ca. B. kirkii. Además, encontramos poca evidencia de coevolución entre los genes repA y el resto de genomas, excepto el Ca. B. punctata, Ca. B. kirkii y Ca. B. schumanniana. En conjunto, estos datos sugieren que la transferencia del replicón pKIR01 es común en simbiontes de nódulos foliares y puede explicar la sospecha de HGT de los genes biosintéticos de aminociclitol C7N en simbiontes de nódulos foliares.

La adquisición de la producción de metabolitos secundarios por parte de HGT se ha documentado en otras simbiosis, en particular la simbiosis defensiva entre insectos que ocurre en el psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri (Nakabachi et al., 2013b). Además, se ha planteado la hipótesis de eventos de HGT entre el simbionte intracelular obligado Candidatus Profftella armatura y el patógeno restringido al floema 'Candidatus Liberibacter asiaticus' (Nakabachi et al., 2013a). Sin embargo, el momento de los eventos HGT no está claro en esos ejemplos. Nuestros datos sugieren fuertemente que la HGT de los genes sintéticos de kirkamida todavía se produjo después de que evolucionó por primera vez la simbiosis de los nódulos foliares. Los HGT intraclado son raros en bacterias simbióticas obligadas, pero los HGT de genes relacionados con bacteriófagos se han documentado en simbiontes de insectos facultativos de Wolbachia, que también se sabe que coinfectan a sus huéspedes (Bordenstein y Wernegreen, 2004). Estamos documentando aquí el primer caso de transferencia horizontal de genes dentro del clado, que parecen tener un papel central en la simbiosis de nódulos foliares obligados.

Aunque los genomas de todos los simbiontes de nódulos foliares se encuentran en un estado de erosión similar, observamos cierta variabilidad en su capacidad de codificación, lo que indica una reducción genómica dinámica y continua. Nuestros datos también muestran que aún puede ocurrir HGT intraclado limitado en las primeras etapas de la reducción del genoma. La cohabitación transitoria de simbiontes y la transferencia conjugativa de plásmidos pueden explicar la presencia de HGT en simbiontes de nódulos foliares. De hecho, nuestros datos proporcionan evidencia a favor de un modo de transmisión de los simbiontes que no es estrictamente vertical. Proponemos insectos como posibles vectores para la transmisión horizontal de bacterias de nódulos foliares a nuevos huéspedes. Los eventos de cambio de huésped podrían resultar en una cohabitación transitoria de distintas especies bacterianas dentro de un nódulo foliar, promoviendo así la HGT entre los simbiontes de los nódulos foliares.

Nuestros datos sugieren que la HGT mediada por plásmidos es una ocurrencia común entre los simbiontes de nódulos foliares. Sin embargo, planteamos la hipótesis de que a medida que las especies de bacterias de los nódulos foliares divergen, el intercambio de material genético se volverá limitado debido a la reducción del rango de huéspedes de plásmidos o la pérdida de la capacidad de colonizar un insecto vector. De hecho, nuestros datos muestran que los plásmidos del grupo pKIR01 pueden integrarse en el cromosoma, impidiendo un mayor intercambio genético. En este sentido, los genomas de los simbiontes de nódulos foliares ofrecen una posibilidad única de investigar las primeras etapas de la reducción del genoma tras la transición a un estilo de vida simbiótico obligado.

En este estudio, observamos que no todos los simbiontes de nódulos foliares son capaces de producir kirkamida. Estos resultados sugieren que la kirkamida tiene un papel defensivo importante pero no es responsable de la naturaleza obligada de la simbiosis. Curiosamente, un estudio filogenético reciente sobre especies noduladas de hojas de Psychotria reveló la presencia de dos especies de plantas no noduladas (P. tetragonopus y P. limba) dentro del clado nodulado, lo que sugiere que los rasgos simbióticos se han perdido en esas especies (Lachenaud, 2013). ).

Nuestro estudio genómico es totalmente consistente con otros estudios que han fechado el origen de la simbiosis de los nódulos foliares en el Mioceno (en un rango de 5,5 a 13,82 millones de años) (Figura complementaria S5) (ver Métodos de información complementaria) (Lemaire et al., 2011; Barrabé et al., 2014). La interacción obligada entre los simbiontes de los nódulos foliares y su planta huésped podría haber evolucionado a partir de una asociación facultativa y comensal inicial (Figura 5). La adquisición de la síntesis de metabolitos secundarios por parte de las bacterias simbióticas probablemente haya sido esencial para la transición a una interacción mutualista y el establecimiento de la simbiosis de los nódulos foliares. Posteriormente, la asociación se volvió permanente y los genomas bacterianos comenzaron a erosionarse. Aislar las etapas intermedias de la simbiosis podría aportar información valiosa sobre este proceso. Por lo tanto, sería interesante explorar las propiedades del genoma de los endófitos de Burkholderia recientemente descritos en plantas Rubiaceae no noduladas (Verstraete et al., 2013).

Hipótesis de la historia evolutiva de la simbiosis de los nódulos foliares. Ancestros de la moderna Psychotria sp. probablemente estaban en asociación transitoria con bacterias comensales endofíticas o posiblemente epífitas. Aproximadamente entre 5,5 y 13,8 millones de años, las bacterias adquirieron genes para la producción de metabolitos secundarios protectores, lo que brindó un beneficio neto de aptitud física a la asociación. A medida que se seleccionaban simbiontes más eficaces, las bacterias simbióticas se transmitían verticalmente, haciendo que la simbiosis fuera permanente. Una consecuencia de esta asociación permanente es la mayor dependencia del huésped de las bacterias de los nódulos foliares, posiblemente debido a la pérdida de vías metabólicas redundantes. Todas las especies modernas noduladas de Psychotria descritas están vinculadas con las bacterias de los nódulos foliares, independientemente de la producción de metabolitos protectores. Las etapas intermedias que se muestran en líneas discontinuas (simbiontes mutualistas de Burkholderia, Rubiáceas noduladas con simbiontes facultativos) son hipotéticas.

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Agradecemos a Rolf Kümmerli y Kentaro Shimizu por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito. MPC agradece el apoyo de la Universidad de Zurich URPP Evolution in Action. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza bajo la subvención CRSII3_154430.

Departamento de Biología Vegetal y Microbiana, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Marta Pinto-Carbó, Thomas Wicker, Leo Eberl y Aurelien Carlier

Departamento de Química, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

Simon Sieber y Karl Gademann

Conservación de plantas y biología de poblaciones, KU Leuven, Lovaina, Bélgica

Steven Dessein y Brecht Verstraete

Jardín Botánico, Meise, Bélgica

Steven Dessein y Brecht Verstraete

Departamento de Química, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Karl Gademann

Laboratorio de Microbiología, Universidad de Gante, Bélgica, 9000, Suiza

Aurelien Carlier

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Correspondencia a Aurelien Carlier.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Información complementaria acompaña a este artículo en el sitio web de The ISME Journal.

Reimpresiones y permisos

Pinto-Carbó, M., Sieber, S., Dessein, S. et al. Evidencia de transferencia horizontal de genes entre simbiontes de nódulos foliares obligados. ISME J 10, 2092-2105 (2016). https://doi.org/10.1038/ismej.2016.27

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Recibido: 27 de septiembre de 2015

Revisado: 29 de diciembre de 2015

Aceptado: 12 de enero de 2016

Publicado: 15 de marzo de 2016

Fecha de emisión: septiembre de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2016.27

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