Patrón y repetibilidad de ascarid.

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 175 (2023) Citar este artículo

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Recientemente se ha propuesto un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de coproantígeno para detectar infecciones por áscaris en pollos. Actualmente se desconoce el patrón de excreción de los antígenos ascáridos a través de las heces de pollo y la consistencia de las mediciones a lo largo de las infecciones. Este estudio evalúa el patrón y la repetibilidad del antígeno del gusano por gramo de heces (APG) y compara el rendimiento diagnóstico del ELISA de coproantígeno con un ELISA de anticuerpos en plasma y yema de huevo y el recuento de huevos en heces de McMaster (M-FEC) en diferentes semanas después de la infección. (wpi).

Se recolectaron muestras de heces, sangre y yema de huevo de gallinas ponedoras que fueron infectadas oralmente con una mezcla de huevos de Ascaridia galli y Heterakis gallinarum (N = 108) o mantenidas como controles no infectados (N = 71). Se realizaron mediciones que incluyeron (a) APG usando un ELISA de coproantígeno, (b) huevos por gramo de heces (EPG) usando la técnica de McMaster y (c) IgY específica de ascáridos en plasma y en yemas de huevo usando un ELISA de anticuerpo específico de ascáridos. entre wpi 2 y 18.

Se cuantificaron las diferencias significativas dependientes del tiempo en APG entre gallinas ponedoras infectadas y no infectadas. En el wpi 2 (t(164) = 0,66, P = 1,00) y 4 (t(164) = −3,09, P = 0,094) no se observaron diferencias significativas entre los grupos, mientras que las gallinas infectadas tenían niveles significativamente más altos de APG que los controles. por wpi 6 (t(164) = −6,74, P < 0,001). Como lo indica una estimación de repetibilidad general alta de 0,91 (IC = 0,89–0,93), la APG podría medirse consistentemente en el mismo individuo. En comparación con McMaster y ELISA de anticuerpos, el ELISA de coproantígeno mostró el rendimiento diagnóstico general más alto (área bajo la curva, AUC = 0,93), aunque las diferencias dependieron del tiempo. Del wpi 6 al 18, el ELISA de coproantígeno tuvo un AUC > 0,95, mientras que el ELISA de IgY en plasma mostró el mayor rendimiento diagnóstico en el wpi 2 (AUC = 0,95). M-FEC tuvo la correlación más alta con la carga total de gusanos, mientras que APG tuvo las correlaciones más altas con los pesos y longitudes de A. galli.

La excreción del antígeno ascárido a través de las heces de pollo se puede medir con alta precisión y repetibilidad utilizando un ELISA de coproantígeno. La excreción de antígeno aumenta con el tiempo y está asociada con la maduración del gusano, particularmente con el tamaño de A. galli. Nuestros resultados sugieren la necesidad del uso complementario de diferentes herramientas de diagnóstico para un diagnóstico más preciso de las infecciones.

La promoción de prácticas que mejoran el bienestar de las gallinas ponedoras está aumentando el uso de sistemas de alojamiento sin jaulas. Cuando se proporciona acceso al aire libre, las gallinas ponedoras pueden expresar mejor su comportamiento natural y tener menos miedo y estrés en un sistema de cría al aire libre [1]. Como consecuencia de mantener a las gallinas en sistemas de alojamiento sin jaulas, los nematodos gastrointestinales, en particular Ascaridia galli y Heterakis gallinarum con rutas de transmisión oral-fecal, se han generalizado y se asocian con pérdidas de producción incluso con signos clínicos mínimos o ausentes [2, 3,4,5,6,7]. En tales sistemas, las gallinas ponedoras están en contacto más estrecho con los excrementos, lo que permite la transmisión oral-fecal de la infección por helmintos [3]. Frenar la propagación de las infecciones y reducir su impacto en la productividad de las gallinas depende en gran medida de un diagnóstico temprano y preciso.

Hay varios criterios importantes a considerar al elegir un método para diagnosticar la infección por helmintos en el ganado. El primero es identificar y diferenciar correctamente todos los animales infectados y no infectados (es decir, diagnóstico cualitativo). La detección temprana de la infección por helmintos puede prevenir la propagación de la infección dentro y entre las parvadas. También podría ser crucial para emplear un tratamiento dirigido a las aves, que podría ser rentable y mitigar el desarrollo de resistencia a los medicamentos entre los parásitos [8]. El segundo criterio es que la herramienta de diagnóstico sea capaz de evaluar la intensidad de la infección (es decir, diagnóstico cuantitativo) estableciendo una correlación significativa entre el resultado de su medición y la carga real de gusanos en el animal huésped. Estimar la intensidad de la infección es importante para las aves de corral y otros animales porque los efectos de la infección por helmintos en la productividad, la salud y el bienestar de los animales probablemente sean mayores cuanto mayor sea la carga de gusanos (p. ej., [9]). Un diagnóstico cuantitativo también es esencial cuando se prueba la eficacia de los antihelmínticos, que actualmente se basa en la reducción del recuento de huevos en heces (FEC) o del recuento de gusanos mediante necropsia [10].

Otro criterio para diagnosticar una infección por helmintos es identificar correctamente las especies de parásitos específicas que causan la infección. Sin embargo, la identificación de especies específicas puede no siempre ser una prioridad en el contexto de la ganadería, especialmente porque múltiples especies coinfectan simultáneamente al huésped [2, 4, 11], y en la práctica a menudo se utilizan antihelmínticos de amplio espectro para controlar diferentes especies. helmintos intestinales [12]. En condiciones naturales, se sabe que A. galli y H. gallinarum coinfectan al pollo huésped [11], y un único ensayo de diagnóstico se considera suficiente para detectar las coinfecciones de ambas especies [13]. Por lo tanto, se debe dar prioridad a los métodos de diagnóstico que tengan un alto valor cualitativo y cuantitativo para evaluar la infección por nematodos en pollos.

El estándar de oro para evaluar la intensidad de la infección por nematodos es contar el número de gusanos en diferentes etapas de desarrollo en el intestino del huésped, pero esto requiere un examen post mortem [14]. Como método indirecto, la presencia e intensidad de la infección por áscaris en pollos generalmente se logra mediante el recuento microscópico de los huevos del parásito en las heces, es decir, el recuento de huevos en heces (FEC) [15]. Las técnicas de recuento de huevos de McMaster y MiniFLOTAC se utilizan habitualmente para cuantificar los huevos de nematodos en las heces de diferentes especies hospedadoras. Como se muestra en dos estudios independientes sobre ascáridos de pollo, McMaster es más preciso y más rápido que MiniFLOTAC, incluso si este último tiene mayor precisión y sensibilidad en recuentos bajos de huevos en heces [16, 17]. Sin embargo, la dependencia de la fecundidad de los gusanos y la intensidad de la infección, entre otros desafíos, puede afectar la confiabilidad de las FEC para evaluar las infecciones por nematodos [18, 19]. Por lo tanto, la medición de la inmunoglobulina Y (IgY) específica de los áscaridos en el plasma del huésped y en las yemas de huevo se ha sugerido como un método de diagnóstico alternativo a las FEC [13, 20]. Recientemente, introdujimos un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de coproantígeno que puede cuantificar antígenos ascáridos solubles en las heces del pollo huésped con alta precisión diagnóstica cualitativa [21]. Daş et al. [22] demostraron que el desarrollo de la respuesta humoral contra A. galli en pollos depende del tiempo, y que los estadios larvales están más fuertemente asociados con la estimulación de anticuerpos que los estadios adultos. Estos cambios asociados con el tiempo y la etapa de desarrollo también pueden esperarse para la excreción de antígenos del gusano. Aún no se ha comparado el rendimiento de las pruebas ELISA para medir anticuerpos y antígenos. Además, hasta ahora ambos ELISA se han evaluado por separado solo en un único momento de la necropsia en infecciones patentes [13, 20, 21]. Por lo tanto, las evaluaciones no pudieron explicar la variación dependiente del tiempo en la producción de anticuerpos en plasma o en yemas de huevo, así como en la excreción de antígenos a través de las heces de gallina. Además, actualmente no existe ningún informe sobre el patrón de excreción de antígenos de gusanos a lo largo de las diferentes fases de las infecciones, es decir, si los antígenos de gusanos en las heces del huésped pueden medirse consistentemente en el mismo individuo a lo largo del tiempo.

Por lo tanto, el primer objetivo de este estudio fue evaluar el patrón de excreción de antígenos de gusanos fecales durante un período de 18 semanas para abordar los cambios dependientes del tiempo en la excreción de antígenos debido a la permeabilidad progresiva y las reinfecciones. Esto también incluyó la estimación de la repetibilidad de las mediciones de la concentración de antígeno fecal en las heces del huésped dentro y entre diferentes semanas posteriores a la infección (wpi). El segundo objetivo fue comparar el rendimiento diagnóstico del coproantígeno ELISA con diferentes herramientas de diagnóstico, incluido el recuento de huevos en heces y la medición de anticuerpos anti-ascaridios en plasma y yema de huevo. Luego se evaluó la capacidad de los métodos de diagnóstico para estimar la intensidad de la infección en diferentes wpi.

El comité de ética para la experimentación con animales de la Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alimentaria y Pesca de Mecklemburgo-Pomerania Occidental (Alemania) aprobó el experimento (número de permiso AZ.: 7221.3-1-080/16). El procedimiento experimental para las infecciones siguió las directrices enumeradas por la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria para aves de corral [23]. El manejo, el cuidado, el alojamiento en corrales y jaulas, el aturdimiento, el sacrificio y las necropsias de los animales fueron realizados por personal capacitado y autorizado de acuerdo con las normas éticas de permiso y bienestar animal.

Para este estudio se utilizaron muestras de sangre, yema de huevo y heces recolectadas de un total de 179 gallinas ponedoras del genotipo Lohmann Brown Plus (LB, N = 109) y Lohmann Dual (LD, N = 70). Las gallinas ponedoras utilizadas en este trabajo provienen de un estudio previo [24], donde evaluamos la tolerancia y resistencia de gallinas ponedoras de diferentes genotipos a las infecciones por nematodos. Las gallinas se obtuvieron de una granja de investigación (Granja para la Educación y la Investigación en Ruthe, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover) como pollitas de 17 semanas de edad y se asignaron aleatoriamente a dos habitaciones adyacentes, cada una con seis corrales. En cada habitación, las gallinas se mantuvieron en tres corrales por genotipo (es decir, tres corrales para cada uno de los genotipos LB y LD). Al comienzo del experimento, el número de gallinas mantenidas en el mismo corral oscilaba entre 8 y 25, con un ajuste por densidad de población de un máximo de seis gallinas/m2. A cada gallina se le dio una etiqueta en el ala para permitir mediciones repetidas en los mismos individuos a lo largo del tiempo.

A las 24 semanas de edad, las gallinas de seis corrales de la primera sala (N = 108) fueron infectadas experimentalmente con A. galli y H. gallinarum, mientras que las gallinas de los seis corrales de la siguiente sala (N = 71) se mantuvieron como controles no infectados. En la Fig. 1 se muestra un diagrama de consorte que presenta el número de gallinas por genotipo y estado de infección, los momentos de la necropsia y los esquemas de muestreo. En los wpi 0, 2, 4, 8, 12 y 16, se asignaron aleatoriamente un total de 29 a 34 gallinas. seleccionados de sus corrales (es decir, se tomaron muestras de todos los corrales con al menos una gallina) y transferidos a jaulas individuales donde permanecieron durante 2 semanas antes de la recolección individual de huevos y el muestreo cuantitativo de heces (es decir, muestreo de 24 horas). Las jaulas (ancho 40 x largo 45 x alto 50 cm) con fondo de malla de alambre se colocaron en un plato de recolección de heces que permitió la recolección diaria cuantitativa de heces de gallinas individuales. Las jaulas proporcionaban equipamiento para la ingesta ad libitum de agua y alimento de las gallinas. Después de un período de adaptación de 10 días en las jaulas, se cuantificaron las heces individuales diarias (g/24 h) de cada gallina repetidamente durante cuatro días consecutivos antes del sacrificio. Las heces diarias se homogeneizaron minuciosamente y las submuestras para las mediciones de antígenos se almacenaron a -20 °C. Después de 2 semanas de cautiverio en las jaulas, es decir, en los wpi 2, 4, 6, 10, 14 y 18, todas las gallinas enjauladas fueron sacrificadas mediante aturdimiento usando un disparo de cerrojo seguido de desangrado hasta la muerte. En cada momento, a partir del 2 al 14 wpi, 18 gallinas infectadas y 11 de control fueron sacrificadas para la necropsia, mientras que las 18 gallinas infectadas y 16 de control restantes fueron sacrificadas en el wpi 18 (Fig. 1). Inmediatamente después del sacrificio, se recogió sangre del sacrificio en tubos tratados con ácido potasio-etilendiaminotetraacético (EDTA) (Kabe Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth, Alemania), y se practicó la necropsia a las gallinas para evaluar la carga de gusanos como una medida directa de la intensidad de la infección. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 20 minutos a 2500 xg y el sobrenadante resultante se almacenó a -20 °C para su posterior análisis. Se recolectaron huevos individuales de cada gallina durante el último día de cautiverio o en el momento del sacrificio. Los huevos de la muestra se abrieron para recoger las yemas. Se recogió una submuestra de yema de huevo (250 µl) y se diluyó con 1,5 ml de agua purificada (pH = 2,5) y se homogeneizó usando un mezclador vórtex. Las yemas de huevo se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Por lo tanto, se registraron un total de 179 muestras de sangre y yema de huevo y 716 (es decir, 179 gallinas × 4 días) muestras fecales de todas las gallinas ponedoras durante el período experimental.

Un diagrama que presenta el flujo experimental con necropsias específicas en el tiempo, esquemas de alojamiento en corrales y jaulas, y el número de gallinas a las que se les tomaron muestras de heces, sangre y yema de huevo.

Se utilizaron virutas de madera como material de cama en los corrales. El día de la infección, la camada se renovó y posteriormente se dejó en el corral durante 18 semanas para permitir que se produjera la infección natural posterior. Todas las gallinas fueron alimentadas con una dieta comercial (ad libitum), que contenía 11,2 MJ de energía metabolizable, 170 g de proteína cruda y 3,6 g de calcio/kg de alimento para gallinas ponedoras [24]. Las condiciones climáticas en las habitaciones se controlaron mediante un sistema automático para garantizar temperatura, luz y aireación constantes en todos los corrales.

El material de infección para el experimento se recolectó de gusanos hembra que residen en los intestinos de gallinas camperas que estaban naturalmente infectadas con ascáridos. El procedimiento para la recuperación y aislamiento de gusanos a partir de intestinos de pollo y la embrionación de huevos de A. galli y H. gallinarum se han descrito previamente [25]. Para la embrionación de huevos de A. galli, se utilizó dicromato de potasio (K2Cr2O7) al 0,1% como medio de incubación, mientras que las hembras intactas de H. gallinarum se mantuvieron en formalina (0,5%) a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 semanas. Se aislaron huevos de H. gallinarum de los gusanos 1 día antes de la infección, como se describe en Stehr et al. [25]. Para la preparación del material de infección que se administrará a las gallinas, los huevos embrionados de ambas especies se enjuagaron en un tamiz de 36 µm y se recogieron en NaCl al 0,9 % en dos grupos de huevos separados (es decir, para A. galli y H. gallinarum por separado). ) a temperatura ambiente. Los grupos de óvulos se evaluaron para determinar el porcentaje de óvulos que estaban completamente embrionados [26]. Después del ajuste de las concentraciones de los huevos embrionados en la solución de NaCl al 0,9% (es decir, 500 huevos de A. galli o H. gallinarum en 0,2 ml de NaCl), se administró un total de 1000 huevos embrionados de ambas especies en 0,4 ml de NaCl. a cada gallina. Las gallinas fueron inoculadas con los huevos infecciosos de los dos parásitos utilizando una cánula esofágica de 5 cm en una dosis única (es decir, 500 huevos de A. galli + 500 huevos de H. gallinarum). A las gallinas de control no infectadas se les administró un placebo oral que contenía 0,4 ml de NaCl al 0,9%.

La carga de gusanos se cuantificó en gallinas ponedoras a las que se les realizó la necropsia en los wpi 2, 4, 6, 10, 14 y 18. Las gallinas se sometieron a ayuno durante 3 h antes de la necropsia para vaciar parcialmente el tracto gastrointestinal (GIT). El TGI se extirpó inmediatamente después de la necropsia, y se separaron el intestino delgado y el ciego, los sitios de predilección de A. galli y H. gallinarum, respectivamente [24]. Luego se abrieron longitudinalmente el yeyuno y el íleon para lavar el contenido intestinal a través de un tamiz (tamaño de malla: 36 μm y 100 μm a 2–6 wpi y 10–18 wpi, respectivamente). Después de eliminar el contenido intestinal, se enjuagó el yeyuno con agua corriente tibia y al mismo tiempo se apretaba el tejido a través de un par de pinzas finas para eliminar los gusanos de la luz adheridos a las paredes del tejido. La recuperación de larvas de tejido se realizó únicamente en el yeyuno mediante una incubación con EDTA [27]. Brevemente, el yeyuno se incubó en 400 ml de solución de EDTA precalentada (EDTA 10 mM, NaCl al 0,9%) durante 22 h a 40 °C. Después de la incubación, el tejido se sumergió en una solución de EDTA para eliminar las larvas. La solución se tamizó a través de un tamiz (tamaño de malla: 20 µm) para recoger las larvas de tejido.

Todos los gusanos recuperados de ambas especies de cada gallina se colocaron en placas de Petri para contarlos, diferenciarlos por sexo y medir su longitud utilizando un estereomicroscopio. El número total de cada uno de los gusanos A. galli y H. gallinarum presentes en el intestino delgado y los ciegos se registró por separado. La carga de gusanos se registró en función de las características morfológicas identificadas de los gusanos, como el sexo (masculino o femenino) y por etapa de desarrollo (es decir, larvas, maduras, inmaduras) [25]. Brevemente, la identificación de gusanos macho se basó en la presencia de espículas. Los gusanos de H. gallinarum se clasificaron como hembras adultas si había huevos en el útero. Los gusanos Ascaridia galli se clasificaron utilizando un límite predeterminado (43,5 mm) para separar con precisión las hembras ovígeras (> 43,5 mm) de las hembras inmaduras (< 43,5 mm) [25]. La longitud del gusano se midió tanto para A. galli como para H. gallinarum utilizando una regla con una precisión de medición de 1 mm. La medición de la longitud se basó en la clasificación de los gusanos (es decir, larvas, inmaduros maduros, machos). Sólo se seleccionaron y midieron al azar gusanos intactos para cada clasificación (máximo de 10 por ave). El promedio de los gusanos seleccionados se multiplicó por el número total de gusanos en cada clasificación [25]. El peso (mg) de A. galli se estimó a partir de la longitud (mm) de A. galli hembra y macho utilizando el modelo de relación peso-longitud de Le cren [28]. También se calculó el peso promedio de A. galli con respecto a la carga total de A. galli en cada gallina. Para establecer la relación peso-longitud de Le cren, utilizamos un conjunto de datos de un experimento anterior (archivo adicional 1: Fig. S1), donde se midieron con precisión tanto el peso como la longitud de A. galli. Para medir el peso de A. galli, se utilizó una balanza analítica de precisión (legibilidad de 0,1 mg) (Mettler Toledo GmbH, Gießen, Alemania). La precisión de las mediciones de longitud fue la misma que en el presente estudio (es decir, 1 mm).

En cada momento de las necropsias (es decir, wpi 2-18), se obtuvo una submuestra aleatoria (4 g) de heces diarias completamente mezcladas, recolectadas 1 día antes de la necropsia de las gallinas y analizadas con la técnica de conteo de huevos de McMaster [15]. Se usó una solución saturada de NaCl (densidad = 1,2 g/ml) como fluido de flotación para los 4 g de heces, que luego se completó hasta 60 ml de la suspensión final. El nivel mínimo de detección de la técnica de recuento de huevos se fijó en 50 huevos por gramo de heces (EPG). Dado que los huevos de A. galli y H. gallinarum no se pueden diferenciar de manera confiable entre sí [29], y los excrementos fecales regulares no se pueden separar con precisión de los excrementos cecales después de un período de recolección de 24 h, se mezclaron los excrementos regulares y los cecales, y Los huevos de ascáridos se contaron juntos.

Se midieron submuestras fecales homogeneizadas tomadas de las heces diarias de gallinas durante los últimos 4 días de cautiverio (es decir, n = 4 muestras/gallina) para determinar la concentración de antígeno del gusano de acuerdo con el procedimiento ELISA descrito por Oladosu et al. [21]. Brevemente, se aislaron antígenos solubles de A. galli a partir de gusanos intactos descongelados mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y etanol al 70%. Posteriormente, los gusanos se homogeneizaron en un mortero y se extrajeron utilizando tampón básico (BisTris 35 mM, Tris 25 mM). Se utilizó antígeno soluble extraído para inmunizar conejos para la producción de anticuerpos. Las placas de ELISA se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 µl del anticuerpo policlonal de conejo anti-ascarid para permitir la unión con el antígeno soluble en muestras fecales. Se pesó un total de 50 mg de muestras fecales diarias en tampón de muestra y se mezclaron completamente con un mezclador vórtex. El sobrenadante se recogió y se pipeteó en pocillos de ensayo. También se añadió a los pocillos de ensayo una alícuota de 100 µl de antígeno soluble con concentraciones de 400, 200, 100, 50, 25 y 0 ng/ml para estandarización. Luego, las placas se incubaron y se lavaron repetidamente antes de las mediciones. Luego se midió la concentración de antígeno en las heces como la cantidad de antígeno ascárido por gramo de heces (APG, µg/g de heces) basándose en la curva estándar para 400, 200, 100, 50, 25 y 0 ng de antígeno soluble/ml [21 ]. La IgY específica anti-ascáridos en plasma y yema de huevo se cuantificó mediante otro ELISA [13]. Las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche a 4ºC con 100 µl del antígeno soluble aislado de A. galli. El suero de pollo estándar se diluyó en serie y se usó como curva estándar en el ensayo. Se agregaron muestras a las placas recubiertas y se incubaron durante 2 h. Después de la incubación, las placas se lavaron repetidamente seguido de otros 30 minutos de incubación con conjugado enzimático, paso de lavado y terminación con ácido clorhídrico. La unión del anticuerpo se expresó en relación con el suero de pollo estándar con alta actividad de anticuerpo (1000 mU/ml por definición) utilizando una logística de cuatro parámetros (4-PL) [13].

Los datos se modelaron basándose en la medición de cada variable, es decir, mediciones únicas o mediciones repetidas de un huésped a lo largo del tiempo. Los parámetros relevantes de la carga de gusanos (recuento de gusanos, longitud de los gusanos, FEC, etc.) se midieron en un único momento durante la necropsia, mientras que la concentración de antígeno se midió en cada una de las muestras fecales recolectadas en cuatro días consecutivos antes de la necropsia (Fig. 1). ). Los datos de APG, IgY de yema de huevo e IgY plasmática se analizaron después de la transformación logarítmica [log(y+1)] para corregir la heterogeneidad de la varianza y producir datos distribuidos aproximadamente normalmente. Una descripción de todas las variables medidas se presenta en la Tabla 1.

Las diferencias significativas en las concentraciones de antígenos y anticuerpos entre las gallinas infectadas y el control no infectado dentro de wpi y sus interacciones se analizaron con análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) utilizando la función PROC MIXED del software basado en la nube SAS OnDemand for Academics (2021). SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte, EE. UU.). La declaración repetida se excluyó para la concentración de anticuerpos en plasma y yema de huevo, ya que solo se realizó una medición en la necropsia. El modelo para las concentraciones de antígenos y anticuerpos incluyó los efectos fijos de la infección, wpi y sus interacciones, mientras que el corral, el genotipo del huésped y el día de muestreo se consideraron efectos de bloqueo en el análisis. La estructura de covarianza se estableció en AR (autoregresiva) (1) para el modelo ajustado. Se calcularon medias de mínimos cuadrados para cada efecto fijo y se probó la comparación por pares con las correcciones de Tukey-Kramer para comparaciones múltiples. Los efectos y las diferencias se consideraron significativos a P <0,05.

Se estimó el coeficiente de correlación intraclase (ICC) entre las muestras medidas repetidamente dentro de cada wpi para determinar la repetibilidad de la excreción de antígeno fecal. Se recolectaron repetidamente muestras fecales de ambos grupos de infección para cuantificar la concentración de antígeno de las mismas gallinas ponedoras durante cada uno de cuatro días consecutivos (n = 4 muestras por gallina) en cada wpi (n = 4 × 29–34 muestras por wpi). Las estimaciones de ICC de estas cuatro mediciones repetidas y sus intervalos de confianza (IC) del 95% se calcularon utilizando la función ICC en el paquete R psych versión 2.1.9 [30]. Las estimaciones se basaron en la concordancia absoluta de las mediciones (k = 4), modelo bidireccional de efectos mixtos [31]. Las mediciones con valores de ICC inferiores a 0,5 se definieron como de confiabilidad deficiente, los valores entre 0,5 y 0,7 como confiabilidad moderada, los valores entre 0,75 y 0,9 como confiabilidad buena y los valores superiores a 0,9 como confiabilidad excelente [31].

Se realizó un análisis de las características operativas del receptor (ROC) para evaluar y comparar la precisión diagnóstica del ELISA de coproantígeno con la del ELISA de IgY de FEC, plasma y yema de huevo utilizando muestras recolectadas 1 día antes del sacrificio. La comparación por pares del área bajo la curva (AUC) de todas las pruebas de diagnóstico se llevó a cabo utilizando la prueba post hoc de DeLong [32] porque las muestras de heces, yema de huevo y sangre utilizadas para las mediciones de FEC, coproantígeno e IgY se realizaron en el mismo anfitrión. La precisión de las pruebas de los ensayos se interpretó en función del rango del valor AUC y se clasifica de la siguiente manera: precisión baja (0,5 < AUC ≤ 0,7), precisión moderada (0,7 < AUC ≤ 0,9) o precisión alta (AUC > 0,90) [33 ].

Los conjuntos de datos utilizados para la comparación de la República de China incluyeron valores de APG, EPG, plasma y yema de huevo de IgY de gallinas ponedoras infectadas experimentalmente con sus correspondientes controles obtenidos durante la necropsia. El análisis se realizó para los datos agrupados en wpi y dentro de wpi para determinar las diferencias entre diferentes puntos temporales, es decir, posibles diferencias dependientes del tiempo en el rendimiento general de diferentes pruebas. En cualquier caso, el número total de observaciones (n ≥ 28) utilizadas para el análisis excedió el tamaño de muestra mínimo requerido para un análisis ROC. El tamaño mínimo de la muestra se calculó utilizando el software estadístico MedCalc versión 20.023 [34] con un nivel de significancia preestablecido de 0,05, un AUC máximo de 0,99 y una proporción de grupo de 1 [33]. Todos los parámetros de la prueba de comparación ROC y DeLong se calcularon utilizando el paquete de código abierto pROC para R [35].

Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para determinar la interdependencia entre los parámetros relacionados con la infección, incluida la carga de gusanos, la longitud y el peso de los gusanos, las FEC y la concentración de antígeno en las heces. El análisis se basó en datos transformados logarítmicamente [log(y+1)]. Para evaluar más a fondo la calidad de cada método de diagnóstico, se examinaron las correlaciones de Pearson entre todas las variables (es decir, IgY específica de ascáridos en plasma y yema de huevo, APG y EPG con parámetros de carga de gusanos) dentro de cada wpi. El análisis de correlación de Pearson, la estadística descriptiva y la visualización de datos se realizaron en el entorno R para computación estadística [36].

Los efectos fijos de la infección (F (1164) = 211,05, P <0,001), wpi (F (5164) = 18,60, P <0,001) y sus interacciones (F (5164) = 15,85, P <0,001) sobre la concentración de antígeno ( APG) fueron significativas (Tabla 2). La comparación por pares ajustada de Tukey-Kramer para el efecto dentro de wpi reveló que la concentración de antígeno no fue significativamente diferente entre los animales de control y los infectados en wpi 2 (t(164), = 0,66, P = 1,00) y wpi 4 (t(164), = −3,09, P = 0,094) (Fig. 2). La APG aumentó en las gallinas ponedoras infectadas en el wpi 6 (t(164), = −6,74, P < 0,001), y luego se observaron diferencias significativas (P < 0,001) entre las gallinas ponedoras infectadas y no infectadas hasta el final del experimento en el wpi 18. Las gallinas de control no fueron significativamente diferentes (post hoc, Tukey-Kramer ajustó P > 0,05) en su concentración de antígeno en diferentes wpi a lo largo del experimento (Fig. 2), mientras que hubo un aumento estadísticamente significativo (P <0,05) en el APG. Valores de gallinas ponedoras infectadas en todo el WPI. La APG en las gallinas ponedoras infectadas fue significativamente diferente (t(164), = −4,62, P < 0,001) en las primeras etapas de la infección (entre las etapas 2 y 4), mientras que en las fases posteriores (p. ej., entre las etapas 6-18, [t(164), = −3,09, P = 0,094]) no hubo diferencias significativas en el APG de las gallinas ponedoras infectadas.

Concentración de antígenos ascáridos en heces (APG) de gallinas ponedoras control (círculo negro) e infectadas (círculo azul). El efecto de la infección, wpi y su interacción fueron significativos (P <0,001). Los análisis estadísticos se basan en datos transformados logarítmicamente [log(y+1)], mientras que la visualización se basa en datos no transformados. * Indica una diferencia significativa entre las gallinas ponedoras de control y las infectadas en un momento determinado (Tukey-Kramer, P <0,05). Cada punto en el gráfico representa una observación individual. El número de observaciones (N = 716) se refiere a 179 gallinas muestreadas durante cuatro días consecutivos antes del sacrificio. La línea vertical dentro de los diagramas de caja muestra la mediana de la muestra, mientras que los extremos inferior y superior del cuadro representan los cuantiles 25 y 75, respectivamente.

Las estimaciones de ICC de la medida repetida de APG se muestran en la Fig. 3. En general, el análisis reveló una estimación de alta repetibilidad (ICC = 0,91; IC del 95 % = 0,89–0,93) para la medición de APG del mismo animal en cuatro mediciones repetidas dentro de un wpi. Sin embargo, hubo fluctuaciones en la repetibilidad de la APG a lo largo de diferentes semanas. Las estimaciones de ICC para las mediciones en el wpi 2 fueron bajas (ICC = 0,08; IC del 95 % = 0–0,47), pero las mediciones de APG en los restantes wpi mostraron estimaciones de repetibilidad de moderadas a altas (ICC 0,78–0,96). La estimación de repetibilidad más alta (ICC = 0,96; IC95% = 0,94–0,98) se registró en las mediciones obtenidas en wpi 6.

Coeficiente de correlación intraclase (ICC) de mediciones repetidas de la concentración de antígeno por gramo de heces dentro de cada semana posterior a la infección (wpi) y el ICC general. Número de gallinas a las que se les realizó la necropsia, n = 29 en cada wpi, y en wpi 18, n = 34 (en total N = 179 gallinas). Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%

Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en la concentración general de IgY específica de ascáridos tanto en plasma (F(1164) = 82,85, P <0,001) como en yema de huevo (F(1151) = 95,38, P <0,001) entre los controles infectados y no infectados (Tabla 2). La concentración promedio general de IgY en todas las wpi en gallinas ponedoras infectadas fue mayor que en los controles no infectados. Sin embargo, las diferencias dependían del tiempo. Las diferencias en la respuesta de anticuerpos en plasma entre los dos grupos fueron significativas en wpi 2 (t(164) = −6,35, P <0,001), wpi 14 (t(164) = −5,05, P <0,001) y wpi 18 ( t(164) = −5.37, P < 0.001) (Fig. 4a), mientras que se observaron diferencias significativas en las concentraciones de IgY en la yema de huevo en wpi 4 (t(151) = −5.78, P < 0.001), wpi 14 (t( 151) = −4,67, P = 0,0004) y wpi 18 (t(151) = −6,29, P <0,001) (Fig. 4b).

Concentraciones de IgY específica de ascáridos en plasma a y b yemas de huevo de control (círculo negro) y gallinas ponedoras infectadas con ascáridos (círculo azul). El efecto de la infección y la interacción con wpi fueron significativos (P <0,001). Los análisis estadísticos se basan en datos transformados logarítmicamente [log(y+1)] mientras que la visualización se basa en datos no transformados (n = 179 gallinas). * Indica una diferencia significativa entre las gallinas ponedoras de control y las infectadas en un momento determinado (Tukey-Kramer, P <0,05). Cada punto en el diagrama de caja representa una observación individual. La línea vertical dentro de los diagramas de caja muestra la mediana de la muestra, mientras que los extremos inferior y superior del cuadro representan los cuantiles 25 y 75, respectivamente.

Anteriormente se informó una presentación detallada de la carga de gusanos en ambos genotipos del huésped [24]. La Figura 5 proporciona representaciones visuales de la carga de gusanos de las gallinas con A. galli y H. gallinarum, así como de la FEC resultante de ambos nematodos. El número de gusanos fue mayor en wpi 2 tanto para A. galli (Fig. 5a) como para H. gallinarum (Fig. 5b). El número de gusanos A. galli disminuyó con el tiempo a lo largo del período experimental, de modo que el número más bajo de gusanos se recuperó en el wpi 18, mientras que el recuento más bajo de H. gallinarum se recuperó en el wpi 10. El número de H. gallinarum aumentó desde el wpi 14 a wpi 18 debido a reinfecciones. La EPG no se cuantificó hasta el wpi 4 (Fig. 5c). La EPG promedio aumentó entre la wpi 4 y la wpi 6 y luego permaneció relativamente constante hasta la wpi 14, mientras que la EPG promedio más alta se observó en la última wpi. Los huevos de gusanos no estuvieron presentes en las heces de las gallinas ponedoras de control durante todo el período del experimento.

Carga de gusanos en gallinas ponedoras infectadas experimentalmente con Ascaridia galli (a) y Heterakis gallinarum (b), y el número de huevos por gramo de heces (EPG) (c) en diferentes semanas después de la infección (n = 108). Las cifras son medias LS con sus errores estándar. La EPG se determinó mediante wpi 4. Por lo tanto, el número de muestras fecales para la EPG fue n = 90

Se llevó a cabo un análisis ROC para investigar la precisión diagnóstica del ELISA de coproantígeno en comparación con FEC, yema de huevo y ELISA de IgY en plasma utilizando todas las mediciones tomadas dentro de cada wpi durante el experimento. Los resultados del análisis ROC se resumen en la Fig. 6, y los resultados detallados con parámetros de rendimiento de prueba específicos (p. ej., AUC, sensibilidad, especificidad) se presentan en el archivo adicional 2: Tabla S1. La precisión general del ELISA de coproantígeno fue alta, con AUC = 0,93. Excepto para los wpi 2 y 4, se confirmó una alta precisión (AUC > 0,90) para este método en todos los wpi. La precisión de su prueba de diagnóstico fue máxima en wpi 18 (AUC = 1,00). De manera similar, la especificidad y sensibilidad del ensayo aumentaron con el tiempo; en el wpi 4, el ensayo arrojó una especificidad del 100% pero con una sensibilidad baja del 39%. Para comparar completamente la precisión del método ELISA de coproantígeno (es decir, APG) con los recuentos de huevos fecales (es decir, EPG) y el ELISA de IgY en plasma y yema de huevo, se utilizaron los datos disponibles para el ensayo de EPG e IgY. El AUC general para FEC fue 0,91, mientras que el ensayo de IgY en plasma y yema de huevo arrojó una precisión general de AUC = 0,83 y 0,88, respectivamente (Fig. 5a). La prueba DeLong no mostró diferencias significativas entre ELISA de coproantígeno y FEC (Z = 0,674, P = 0,501) y ELISA de IgY de yema de huevo (Z = 1,645, P = 0,100), mientras que la precisión general del ensayo de IgY en plasma fue significativa (Z = 2,336). , P = 0,019) inferior. Tanto el ELISA de FEC como el de coproantígeno tuvieron una especificidad del 100%, mientras que la especificidad fue menor para el ensayo de IgY en plasma (72,9%) y el ensayo de IgY en yema de huevo (80%). FEC demostró la sensibilidad más alta, con un 82,2 %, seguida de la IgY de yema de huevo con una sensibilidad del 80 %, mientras que tanto el coproantígeno como el ELISA de IgY plasmático tuvieron una sensibilidad del 76,7 %.

Exactitud diagnóstica general (a) y específica de un punto temporal (b) del ELISA de coproantígeno en comparación con el ELISA de IgY en plasma y yema de huevo y los recuentos de huevos en heces en pollos infectados con Ascaridia galli y Heterakis gallinarum. La línea diagonal corresponde a la mitad del área máxima bajo la curva (AUC = 1,0). Se utilizó la prueba de DeLong para determinar diferencias significativas entre el AUC de cada prueba diagnóstica. El nivel de significancia se preestableció en P <0,05. Los valores de AUC con los mismos superíndices no mostraron diferencias significativas. Cuanto más lejos esté la ubicación de la curva ROC de la línea diagonal, mayores serán los análisis de precisión total de la prueba. En (b) se muestra un resumen de los valores de AUC con sus intervalos de confianza para todos los métodos de diagnóstico dentro de cada wpi.

Investigamos las relaciones lineales entre todos los parámetros relacionados con la infección utilizando estadísticas de correlación de Pearson con datos agrupados durante todas las semanas (Fig. 7a) y dentro de cada wpi (Fig. 7b) para cada medición de diagnóstico. Los parámetros asociados con la longitud y el peso de los gusanos demostraron coeficientes de correlación positiva más altos con APG que con EPG y ambos con IgY. La longitud promedio total de A. galli mostró una correlación positiva significativa con APG (r(105) = 0,69, P <0,001) y EPG (r(87) = 0,65, P <0,001). En el caso de H. gallinarum, la longitud total del gusano demostró correlaciones positivas significativas con APG (r(102) = 0,61, P <0,001) y EPG (r(84) = 0,38, P = 0,030). Sin embargo, se encontró una correlación negativa entre la IgY plasmática y la longitud total tanto de A. galli (r(105) = −0,31, P = 0,100) como de H. gallinarum (r(102) = −0,40, P = 0,010). El peso de A. galli mostró una correlación significativa (r(105) = 0,71, P < 0,001) con APG y EPG (r(87) = 0,68, P < 0,001).

Correlaciones generales con datos agrupados en wpi entre diferentes variables que representan la carga de gusanos y las mediciones de diagnóstico (a), y coeficientes de correlación de Pearson entre cada variable de carga de gusanos y APG, EPG e IgY dentro de cada wpi (b) (n ≥ 29). Los coeficientes de correlación de Pearson (r) se presentan en los cuadrados. Las correlaciones significativas (P < 0,05) se indican con un asterisco (*)

Sólo el EPG mostró una alta correlación con el recuento total de gusanos de A. galli (r(87) = 0,44, P <0,001) y H. gallinarum (r(87) = 0,32, P = 0,110). Sin embargo, cuando examinamos la correlación con el número de gusanos por madurez, hubo una correlación positiva significativa entre APG y el número total de gusanos adultos (r(105) = 0,6, P <0,001 para A. galli y r(105) = 0,52, P < 0,001 para H. gallinarum), y una correlación negativa con el número total de larvas (r(105) = −0,59, P < 0,001 para A. galli y r(105) = −0,44, P < 0,001 para H. gallinarum). EPG se correlacionó negativamente con las larvas de A. galli (r(87) = −0,31, P = 0,160) y positivamente con gusanos maduros (r(87) = 0,69, P <0,001 con A. galli y r(87) = 0,33, P = 0,070 con H. gallinarum). La IgY en plasma demostró una correlación positiva con las larvas de H. gallinarum (r(105) = 0,54, P <0,001) y las larvas de A. galli (r(105) = 0,25, P = 0,370), pero la IgY en yema de huevo no. Investigamos más a fondo si las correlaciones entre la carga de gusanos y los indicadores de infección dependen del tiempo. El resultado de la Fig. 7b muestra que la correlación más alta se produjo en diferentes wpi para cada uno de los cuatro representantes de infección. Las correlaciones fueron más bajas en wpi 2 para todos los métodos. En general, la EPG mostró correlaciones positivas significativas con el recuento de gusanos y las mediciones de tamaño en la mayoría de las wpi (Fig. 7b; Panel EPG).

Este estudio evaluó el patrón de excreción y la repetibilidad del antígeno ascárido en las heces de gallinas ponedoras a lo largo del tiempo y evaluó el desempeño de cuatro métodos diferentes para diagnosticar infecciones por nematodos, con énfasis en las alteraciones en el desempeño de las pruebas en diferentes momentos de la infección. Los métodos incluyeron recuentos de huevos en heces de McMaster, ELISA de coproantígeno y ELISA de IgY en plasma y de yema de huevo. De los resultados se desprende claramente que los antígenos solubles de los gusanos se excretan de forma bastante consistente a través de las heces de las gallinas ponedoras. Las concentraciones de antígeno aumentaron con el tiempo en las heces de las gallinas infectadas, lo que indica la posibilidad de que a medida que los gusanos maduran, la concentración de antígeno aumente. De manera dependiente del tiempo, el aumento de la concentración de antígeno también puede ser un reflejo de una mayor carga de gusanos y de reinfección.

Para confirmar si la APG se puede medir consistentemente en la misma gallina a lo largo del tiempo, realizamos estimaciones de repetibilidad de la excreción de antígeno midiendo la concentración de antígeno de muestras fecales de las mismas gallinas individuales durante cuatro días consecutivos dentro de un wpi determinado. La repetibilidad es la medida que refleja el grado en que un conjunto de mediciones puede replicarse de manera confiable midiendo tanto la correlación como el acuerdo absoluto entre los valores obtenidos [37]. La repetibilidad global (ICC = 0,91) confirma un patrón repetitivo considerable en la excreción de antígenos en las heces. A partir del wpi 4, cuando el antígeno pudo cuantificarse de manera confiable, la concordancia entre las mediciones durante los cuatro días de muestreo fue alta, lo que sugiere que la excreción de antígeno en las heces de las gallinas infectadas ocurrió constantemente a diario y se puede medir de manera confiable en el mismo animal.

Además, los resultados también mostraron diferencias únicas dependientes del tiempo en el rendimiento de las pruebas de diferentes métodos de diagnóstico, lo que implica la necesidad de una selección específica de una o dos herramientas para capturar una indicación más informativa de las infecciones por nematodos en pollos. Los recuentos de huevos fecales se utilizan ampliamente para evaluar las infecciones por A. galli y H. gallinarum, pero debido a desafíos como la variabilidad en la fecundidad de las lombrices, la variación diurna en la excreción de huevos y la distribución desigual de los huevos en las heces [19, 38], se han desarrollado nuevos métodos. sido investigado. Esto incluye la medición de anticuerpos específicos de gusanos en el plasma del huésped y las yemas de huevo [13, 20] y antígenos solubles de gusanos en las heces del huésped [21], así como enfoques basados en PCR [39]. La IgY plasmática específica de ascáridos ya era significativamente diferente entre las gallinas infectadas y no infectadas en el wpi 2, lo que concuerda con todos los estudios anteriores relevantes que miden la respuesta inmune a la infección por nematodos en pollos [22, 40,41,42]. Deducimos que el diagnóstico con ELISA de anticuerpos puede proporcionar una detección más temprana de la infección que el recuento de huevos en heces o el ELISA de coproantígeno. Las larvas de Heterakis gallinarum son transportadas a los ciegos casi 9 h después de la ingestión de los óvulos por parte del huésped, donde las larvas se incrustan en el epitelio superficial durante un corto período de tiempo [43]. De manera similar, las larvas de A. galli tienen una fase asociada a tejidos [44]. Así, en el wpi 2, las paredes del intestino delgado y los ciegos del huésped están colonizadas principalmente por larvas, y casi no hay gusanos adultos presentes en este momento, pero en el wpi 4, la respuesta de anticuerpos, cuantificada por ELISA, disminuye, coincidiendo con la presencia de gusanos maduros en la luz. Esto apoya la idea de que las larvas, que penetran la pared intestinal de los pollos infectados, provocan una respuesta humoral más fuerte que los gusanos adultos que han migrado a la luz [41]. Por lo tanto, la migración de las larvas desde las paredes intestinales a la luz puede haber dado lugar a una menor producción de anticuerpos en las semanas siguientes. Sin embargo, en el wpi 14, lo que indica la presencia de la siguiente generación de larvas debido a la reinfección, la respuesta de anticuerpos volvió a ser significativamente mayor en las gallinas infectadas. El estudio de Marcos-Atxutegi et al. [41] establecieron que el antígeno soluble de huevos embrionados estimula una mayor concentración de anticuerpos medida por ELISA que el antígeno del gusano adulto. De manera similar, nuestros resultados de la correlación entre la IgY plasmática y las etapas de los gusanos demostraron además que la IgY plasmática tiene una relación positiva más fuerte con el número de larvas que con los gusanos adultos. Este resultado también es consistente con un informe anterior mostrado por Daş et al. [22]. Esta relación fue mucho más fuerte con larvas de H. gallinarum que con A. galli, probablemente debido a la mayor reinfección con H. gallinarum que con A. galli [24].

A medida que el pollo huésped desarrolla anticuerpos de reacción cruzada contra las dos especies de nematodos estrechamente relacionadas [13], una mayor reinfección con H. gallinarum que con A. galli podría explicar correlaciones más altas entre los recuentos de larvas de IgY específica de ascáridos y H. gallinarum. A pesar de estudiar múltiples puntos temporales, la IgY plasmática no tuvo una relación significativa con la carga total de gusanos, lo que la hace menos adecuada para el diagnóstico cuantitativo de la infección por nematodos en pollos. Sin embargo, en términos de evaluación diagnóstica cualitativa, medir la IgY plasmática específica de áscaridos puede ser valiosa considerando su precisión, sensibilidad y especificidad diagnóstica relativamente altas obtenidas en este estudio. Los valores de sensibilidad oscilaron entre 66 y 88% en todos los wpi. Este valor es menor en comparación con estudios anteriores. Sharma y cols. [20] informaron una sensibilidad diagnóstica del 96% para la IgY plasmática en la detección de infección por A. galli en pollos, que fue similar al resultado informado por Daş et al. [13], quienes también informaron una sensibilidad del 94%. Como se indica en este estudio, el momento de la recogida de la muestra influye en el rendimiento diagnóstico del método utilizado. Aquí, el rendimiento diagnóstico del ELISA de anticuerpos se evaluó continuamente en diferentes wpi hasta el wpi 18, a diferencia de los estudios antes mencionados donde la evaluación se realizó solo a 25 wpi y 28 wpi, respectivamente, y puede ser responsable de las diferencias en los resultados. Sin embargo, las mediciones de IgY en plasma pueden considerarse una herramienta confiable para la detección temprana de la infección por nematodos en pollos.

Por el contrario, la FEC, aunque no es cuantificable hasta el wpi 4 debido al período previo a la patente [45, 46], muestra una relación consistente y considerablemente más fuerte con la carga total de gusanos. No sorprende que la FEC no pudiera evaluarse hasta la semana 4, porque el recuento de huevos en las heces depende de la presencia de gusanos hembra con madurez reproductiva en el intestino del huésped, y las larvas tardan entre 5 y 8 semanas en alcanzar la madurez y comenzar a desarrollarse. derramar huevos, dependiendo de varios factores [45]. Es bien sabido que la FEC es un buen reflejo de la intensidad de la infección, pero como se muestra en este estudio, la relación difiere según el momento de la medición. En el wpi 4, la FEC mostró una correlación baja con los gusanos adultos, mientras que a partir del wpi 6, la FEC demostró una correlación moderadamente alta con la carga total y adulta de los gusanos (Fig. 7b). Feyera et al. [47] encontraron un rango similar de correlación en los wpi 8 y 10. Como los huevos de las dos especies de nematodos no se pueden diferenciar de manera confiable [29], las correlaciones actuales entre EPG y la carga de gusanos de cada especie también podrían haberse subestimado.

El análisis ROC mostró que en el wpi 2, el ELISA de coproantígeno no pudo diferenciar con precisión entre gallinas infectadas y no infectadas en esta fase temprana. De manera similar, no hubo diferencias significativas en la concentración de antígeno fecal entre los dos grupos en este momento. Esto probablemente se debe a que el ELISA de coproantígeno no es lo suficientemente sensible para detectar la concentración posiblemente baja de antígenos liberados por las larvas pequeñas. Sin embargo, desde el wpi 4 hasta el final del experimento, el coproantígeno mostró una sensibilidad y especificidad diagnóstica en el rango de 61 a 100% y 90 a 100%, respectivamente. Se necesitan más estudios para confirmar si el antígeno del gusano excretado en las heces depende o está asociado con la eliminación de huevos. Un estudio de este tipo podría evaluar los cambios en la concentración de antígeno fecal en presencia o ausencia de huevos de gusanos añadidos a las heces. En general, el análisis ROC demostró un rendimiento cualitativo mayor para ELISA de coproantígeno que para ELISA de IgY y FEC, excepto en wpi 2, cuando el ELISA de IgY en plasma fue más sensible. La correlación entre APG y la carga total de H. gallinarum y A. galli fue mayor en el WPI 4 y el WPI 6, respectivamente. APG se correlacionó mejor con el peso de A. galli que con el número de gusanos A. galli, lo que implica la excreción de más antígenos de los gusanos más grandes; sin embargo, los datos sobre el peso de H. gallinarum no están disponibles para realizar comparaciones. Según los datos disponibles, puede ser razonable suponer que la concentración de antígeno fecal refleja más el tamaño del gusano que el número de gusanos.

Concluimos que los antígenos solubles de los gusanos se excretan consistentemente a través de las heces de un huésped infectado y pueden medirse repetidamente en la misma gallina a lo largo del tiempo. En comparación con otros métodos, el coproantígeno ELISA proporciona el mejor método de diagnóstico cualitativo. Se ha demostrado que el ensayo de IgY en plasma es la herramienta más fiable para el diagnóstico precoz de la infección por nematodos. Finalmente, en términos de intensidad de la infección, la FEC es superior y sigue siendo un mejor indicador de la carga total de gusanos adultos, pero sólo después de la permeabilidad. Sugerimos que la combinación de diferentes herramientas en lugar de una sola daría un mejor reflejo de las infecciones como resultado de los cambios en la etapa de desarrollo, el tamaño del gusano y la fecundidad a lo largo del tiempo. Esto sugiere la necesidad del uso complementario de diferentes herramientas para un diagnóstico y cuantificación más preciso de las infecciones.

Los datos utilizados en este estudio se depositaron en un repositorio de datos de código abierto (DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7974367).

Antígeno por gramo de heces

Área bajo la curva

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Huevos por gramo de heces

recuento de huevos en heces

Características operativas del receptor

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Los autores desean agradecer a Birgit Mielenz (FBN) y Birgit Sohnrey (Universidad de Göttingen) por su asistencia técnica. También agradecemos al personal técnico del Instituto de Investigación de Biología Animal de Granja, Dummerstorf, por su invaluable ayuda en la realización de los experimentos.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Este trabajo es el resultado del proyecto MONOGUTHEALTH, que ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie nº 955374. El experimento de infección se realizó anteriormente en el marco del Proyecto Integhof (Alemania). ) respaldado por los fondos del Fondo de Propósito Especial del Gobierno Alemán mantenido en Landwirtschaftliche Rentenbank (Subvención no. 28RZ3-72.051).

Instituto de Investigación de Biología Animal de Granja (FBN), Instituto de Fisiología Nutricional 'Oskar Kellner', Wilhelm-Stahl-Allee 2, 18196, Dummerstorf, Alemania

Oyekunle John Oladosu, Manuel Stehr, Cornelia C. Metges y Gurbuz Stone

Grupo TECOmedical, Marie-Curie-Str. 1, 53359, Rheinbach, Alemania

Mark Hennies

Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad Libre de Bozen-Bolzano, Universitätsplatz 5, 39100, Bolzano, Italia

Matthias Gauly

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GD, CCM y MG concibieron el estudio. MH y GD desarrollaron el sistema ELISA de coproantígeno. GD y MS indujeron las infecciones experimentales y realizaron los experimentos con pollos. OJO realizó el análisis estadístico de todos los datos. OJO y GD interpretaron los datos. OJO escribió el borrador original del manuscrito. GD, CCM, MS, MG y MH revisaron el borrador del manuscrito. GD, MG y CCM contribuyeron a la financiación. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Gürbüz Daş.

La Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alimentaria y Pesca de Mecklemburgo-Pomerania Occidental (Alemania) aprobó el experimento con el número de permiso AZ.: 7221.3-1-080/16. El manejo de animales y los procedimientos experimentales siguieron las reglas de bienestar animal.

No aplica.

Mark Hennies trabaja en una red de empresas médicas (TECOmedical Group) que desarrolla y vende pruebas serológicas. Los demás autores no declaran tener posibles intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Relación peso-longitud de gusanos A galli macho (a) y hembra (b). https://doi.org/10.5281/zenodo.7974367.

Parámetros de rendimiento de pruebas cualitativas de diferentes pruebas de diagnóstico derivadas del análisis de las características del operador del receptor (ROC).

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Oladosu, OJ, Hennies, M., Stehr, M. et al. Patrón y repetibilidad de la excreción de antígeno específico de ascáridos a través de las heces de pollo, y la precisión diagnóstica de las mediciones de coproantígeno en comparación con los recuentos de huevos de McMaster y las mediciones de anticuerpos en plasma y yema de huevo en gallinas ponedoras. Vectores de parásitos 16, 175 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05782-5

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Recibido: 01 de diciembre de 2022

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 01 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05782-5

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